Занятие 16 Реакции иммунитета (окончание)

• Название: Занятие 16 Реакции иммунитета (окончание)
• Дата: 07.04.2023
• Размер: 36.99 Kb.
• Имя файла: Zanyatie_16_Reaktsii_immuniteta.docx
• Тип: Занятие; #1044980

Занятие 16 Реакции иммунитета (окончание)

1. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки, контроли, практическое применение.

Реакция гемолиза (РГ) – это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента. Компоненты РГ. 1. Антиген - 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия; 2. Антитело - гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины); сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана; 3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок. Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой ("лаковая кровь"). Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.

Антитела могут вызывать лизис, т.е. растворение клеток, только при участии комплемента (С). Следовательно, все реакции с участием С называются реакциями иммунного лизиса. К ним относят: РСК, р. гемолиза, р. бактериолиза.

Реакция гемолиза. Реакция гемолиза используется для определения титра и активности комплемента, а также как индикатор для оценки РСК; реакция локального гемолиза в геле носит название реакции Ерне. Реакция Ерне. Используется для определения числа антителообразующих клеток в лимфоидных органах; в гель вносятся эритроциты, суспензия клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент – число образующихся в результате реакции зон гемолиза равно числу клеток, секретирующих гемолизины.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, ан­титела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритро­цитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лако­вую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для об­наружения комплемента.

 Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант ре­акции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют ком­племент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, об­разуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Гемолиз, как и бактериолиз, происходит при участии специфического антитела и комплемента. Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии гемолитической сыворотки на соответствующие эритроциты в присутствии комплемента получается их растворение (гемолиз), взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость — так называемую лаковую кровь. В отличие от гемолиза эритроцитов, получаемого каким-либо другим путем (например, действием на эритроциты дистиллированной воды, микробного яда и т. д.), действие иммунной гемолитической сыворотки строго специфично, т. е. она вызывает гемолиз только тех эритроцитов, которые были взяты для иммунизации. Реакция гемолиза благодаря своей наглядности получила широкое применение как вспомогательная реакция при постановке серологических диагностических реакций (реакция связывания комплемента Борде — Жангу, реакция Вассермана).

2. Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства?

Реакция связывания комплемента (РСК) – это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая, 2-ая – гемолитическая система. Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается, поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система. РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК. 1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым). 2. Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации). 3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции. 4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана. 5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная). 6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК. Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56С в течение 30 мин. РСК проводят в 2 фазы. I фаза – специфическая: в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин. II фаза – индикаторная: в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин. Учет результатов РСК проводят при безупречных результатах в контролях. Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь". В диагностике инфекционных заболеваний также используются реакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА). 3. С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат?

4. Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Для чего необходимо определение титра и рабочей дозы комплемента? Что произойдёт, если в реакции будет избыток комплемента или недостаточное количество его?

Для инактивации комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) применяется для обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в материале от больного. Эта реакция основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает) комплемент. Однако этот феномен протекает в пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза. Таким образом, в РСК задействованы две системы: специфическая, в которой определяют возможность образования иммунного комплекса антитело + антиген + комплемент, и индикаторная—гемолитическая система, которая включает эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Проведение реакции делится на две фазы. В первую фазу проводят раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во вторую фазу смешивают указанные комплексы, что позволяет определить локализацию комплемента по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов. Так, если имеет место соответствие антигена и антитела, происходит связывание этим комплексом комплемента, а реакция гемолиза будет отрицательной, так как в системе отсутствует свободный комплемент. Если же соответствия между антигеном и антителом нет, комплемент свяжется с гемолитической системой, результатом чего будет гемолиз эритроцитов. РСК широко применяется в диагностике инфекционных болезней — сыпного тифа, туберкулеза, сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде— Жангу), протозойных и вирусных инфекциях. Для постановки реакции необходимы: — исследуемая сыворотка, полученная путем венепункции; — антиген; — комплемент; — эритроциты барана; — гемолитическая сыворотка. Подготовка ингредиентов для постановки РСК: 1. Сыворотку крови, полученную от больного путем венепункции, перед исследованием инактивируют прогреванием на водяной бане (в инактиваторе) при 56 °С в течение 30 мин. Перед постановкой реакции сыворотку разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:5 (0,1 мл сыворотки + 0,4 мл изотонического раствора). 2. Антигеном могут быть взвесь целых бактериальных клеток в дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида, убитых нагреванием при 60 °С в течение 1 ч или при 100 °С в течение 15-20 мин, микробные полисахариды и белки, лизаты и экстракты из микробных культур, патологически измененных и нормальных тканей. Предварительно определяют титр антигена для исключения его антикомпле-ментарности и гемотоксичности. Для этого готовят основное разведение антигена, содержащее 1 млрд, микробных тел в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида (по оптическому стандарту мутности). В ряд пробирок вносят несколько последовательно уменьшающихся доз основного разведения антигена от 0,5 до 0,05 мл, добавляют до 1 мл изотонический раствор и по 0,5 мл рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37 °С в течение 1 ч. После этого во все пробирки вносят по 1 мл смеси гемолитической системы (гемолитической сыворотки + эритроциты барана). Выдерживают 1 ч в термостате при той же температуре и проводят учет результатов. Титром антигена считают наименьшую дозу, при которой прекращается задержка гемолиза и, следовательно, отсутствует его антикомплементарное действие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составляющую примерно 0,5-0,75 его титра. 3. Комплементом является смесь нативных сывороток, полученных от 3-5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах. Перед постановкой РСК комплемент титруют для определения наименьшего его количества (титр комплемента), которое вызывает гемолиз 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 (0,1 мл комплемента + 0,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) и разливают в ряд пробирок в объеме от 0,05 до 0,5 мл. Доводят общий объем в пробирках изотоническим раствором до 1,5 мл и инкубируют в термостате при 37 °С в течение 45 мин. Затем добавляют в каждую пробирку гемолитическую смесь (0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана) в объеме 1 мл. Ставят 2 контроля: — контроль гемолитической системы—1 мл гемолитической смеси + 1,5 мл изотонического раствора; — контроль комплемента—0,5 мл основного разведения комплемента 1:10 + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов + 1,5 мл изотонического раствора. Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 30 мин. Определяют титр комплемента — минимальное количество, при котором еще происходит полный гемолиз эритроцитов. При постановке РСК пользуются рабочей дозой комплемента, которая соответствует титру, увеличенному на 20-30% (это соответствует количеству комплемента в предпоследней пробирке (гемолиз).

Степень интенсивности реакции оценивают по четырехплюсовой системе: ++++ полная задержка гемолиза; жидкость бесцветна, значительный осадок эритроцитов; +++ явная задержка гемолиза; жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов; ++ частичная задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов; + слабая задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, осадок эритроцитов небольшой; ± следы задержки, почти полный гемолиз; осадок в виде облачка; полный гемолиз, «лаковая» кровь, отсутствие осадка. Чувствительность РСК может быть повышена, если ее проводить не при 37 °С, а на холоду (при 4 °С в течение 18 ч).

5. Гемолитическая сыворотка: что содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют?

Гемолитические сыворотки получают путем иммунизации кроликов взвесью эритроцитов барана. Титром сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое в присутствии комплемента вызывает гемолиз 3% взвеси эритроцитов барана. Гемолитические сыворотки используют для титрования комплемента и при постановке реакции связывания комплемента в индикаторной системе.

Получают путём иммунизации кроликов эритроцитами барана l Содержат антитела - гемолизины l

Титр гемолитической сыворотки – максимальное её разведение, которое в присутствии комплемента вызывает лизис 3% взвеси эритроцитов барана l

Используют в реакции иммунного гемолиза (РИГ) для титрования комплемента, гемолитической сыворотки, антигена (перед постановкой основного опыта РСК)

6. Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится?

Комплемент- это система белков крови, которые способны связываться с комплексом антиген-антитело и разрушать антиген (микробную клетку). Разрушение микробной клетки – лизис. Если в организме отсутствуют микробы-антигены, то комплемент находится в неактивном (разрозненном) состоянии.

Состав:

1. Девять белков, составляющих собственно комплемент и обозначаемых поэто­му буквой С: С1...С9, причем С1-компонент состоит из трех белковых субъединиц (С1q, С1г, С1s), все остальные представляют собой единичные белковые молекулы. В составе молекулы имеется рецептор для связывания с Рс-фрагментом молеку­лы антитела. Антитела, относящиеся к иммуноглобулинам различных классов, вза­имодействуют с комплементами с различной степенью активности. Белки С5, С6, С7, С8 и С9 участвуют в организации мембрано-атакующего комплекса.

2. Регуляторные белки: С1Е1, С4bр, фактор Н, фактор I (инактиватор СЗb/С4b), белок S.

3. Факторы, участвующие в альтернативном пути активации системы комплемента: фактор В (протеиназа), фактор В (гликопротеин), фактор Р (пропердин) — у-глобулин, его обнаружил в 1954 г. Л. Пиллемер. Этот белок, образуя комплекс с эндоток­сином, в присутствии ионов Mg разрушает С3, поэтому был назван пропердином. Пропердин стабилизирует СЗ-конвертазу альтернативного пути.

Функции комплемента многообразны: а) участвует в лизисе микробных и других клеток (цитотоксическое действие); б) обладает хемотаксической активностью; в) принимает учас­тие в анафилаксии; г) участвует в фагоцитозе. Следовательно, комплемент является компонен­том многих иммунологических реакций, направ­ленных на освобождение организма от микробов и других чужеродных клеток и антигенов (на­пример, опухолевых клеток, трансплантата).

Механизм активации комплемента представляет собой каскад фер­ментативных протеолитических реакций, в результате которого образуется активный цитолитический комплекс, разрушающий стен­ку бактерии и других клеток. Известны три пути активации комплемента: классический, альтернативный и лектиновый.

По классическому пути комплемент активирует­ся комплексом антиген-антитело. Для этого достаточно участия в связывании антигена одной молекулы IgM или двух молекул IgG. Процесс начинается с присоединения к ком­плексу АГ+АТ компонента С1, который рас­падается на субъединицы Clq, Clr и Сls. Далее в реакции участвуют последовательно активированные «ранние» компоненты комплемента в такой последовательности: С4, С2, СЗ. Эта реакция имеет характер усиливающе­гося каскада, т. е. когда одна молекула пре­дыдущего компонента активирует несколько молекул последующего. «Ранний» компонент комплемента С3 активирует компонент С5, который обладает свойством прикрепляться к мембране клетки. На компоненте С5 путем последовательного присоединения «поздних» компонентов С6, С7, С8, С9 образуется литический или мембраноатакующий комплекс который нарушает целостность мембраны (образует в ней отверстие), и клетка погибает в результате осмотического лизиса.

Альтернативный путь активации комплемен­та проходит без участия антител. Этот путь характерен для защиты от грамотрицательных микробов. Каскадная цепная реакция при аль­тернативном пути начинается с взаимодействия антигена (например, полисахарида) с протеи­нами В, D и пропердином (Р) с последующей активацией компонента СЗ. Далее реакция идет так же, как и при классическом пути — образу­ется мембраноатакующий комплекс.

Лектиновыи путь активации комплемента также происходит без участия антител. Он ини­циируется особым маннозосвязывающим белком сыворотки крови, который после взаимодейс­твия с остатками маннозы на поверхности мик­робных клеток катализирует С4. Дальнейший каскад реакций сходен с классическим путем.

В процессе активации комплемента обра­зуются продукты протеолиза его компонен­тов — субъединицы СЗа и СЗb, С5а и С5b и дру­гие, которые обладают высокой биологической активностью. Например, СЗа и С5а принимают участие в анафилактических реакциях, являют­ся хемоаттрактантами, СЗb — играет роль в опсонизации объектов фагоцитоза, и т. д. Сложная каскадная реакция комплемента происходит с участием ионов Са²⁺ и Mg²

7. Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента? Каким способом обрабатывают комплемент для получения препарата с длительным сроком хранения?

 Для получения одной серии комплемента делается смесь сыворотки от 30-50 свинок. Обработка крови для получения сыворотки производится обычным, описанным выше
способом.
Консервантом в жидком комплементе является смесь из 4,5 % раствора борной кислоты и сернокислого натрия. Сила комплемента определяется его титром, т.е. наименьшей дозой, способствующей полному гемолизу 1 мл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Для постановки реакций иммунитета (гемолиз, бактериолиз, РСК) берут рабочую дозу комплемента, которая на 20-30 % превышает вытитрованную минимальную дозу, так как в реакциях активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами (антигеном, сывороткой).
Комплемент пригоден к отпуску при титре от ОД до 0,25 в разведении 1:10. Он должен быть прозрачным, негемолизированным, обладать способностью адсорбироваться комплексом антиген + антитело и не быть гемотоксичным.
Комплемент выпускается в жидком виде со сроком годности в 2 месяца при условии хранения при температуре 3-6 °С и в высушенном состоянии со сроком годности в 3-4 года.
Препарат сухого комплемента сохраняется при обычной комнатной температуре.

8. При постановке каких реакций иммунитета (из перечисленных) необходимо добавлять комплемент: реакция нейтрализации токсина антитоксином, реакция преципитации, реакция агглютинации, реакция иммунного бактериолиза, реакция иммунного гемолиза, РСК?

9. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ): принцип реакции; укажите последовательность процессов при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты; что является антигеном, что - антителами, чем помечены антитела; как учитывается результат реакции, с помощью какого микроскопа; как выглядит положительный результат; практическое применение - что можно обнаружить с помощью этой реакции?

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

10.Непрямая реакция иммунофлюоресценции - укажите последовательность событий при этой реакции; преимущество по сравнению с прямой РИФ.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

11. Иммуноферментный анализ (ИФА) - принцип реакции; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; то же - при обнаружении антител.

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента расщепляется и среда окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА. 1. Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела-антиген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску. 2. Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антигенантитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше. В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах. ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

12. Иммуноблоттинг - принцип реакции, основные этапы; как учитывается результат; преимущества реакции по сравнению с ИФА.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые 72 молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента расщепляется и среда приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса

13. Радиоиммунный анализ (РИА) - основные этапы реакции, какие сыворотки применяются, чем они помечены, как учитывается результат?

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченый радиоизотопом, например, I125. В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счётчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

14. Иммунная электронная микроскопия - принцип метода; основные этапы; какая сыворотка применяется, чем она помечена; как учитывается результат реакции?

Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.