Занятие 5(с). Занятие 5 тема занятия Методы иммобилизации ферментов и целых клеток

• Название: Занятие 5 тема занятия Методы иммобилизации ферментов и целых клеток
• Дата: 25.10.2022
• Размер: 247 Kb.
• Имя файла: Занятие 5(с).doc
• Тип: Занятие; #753428
• страница: 2 из 5

Стрептодеказа для инъекций:

Стрептодеказа для инъекций – препарат пролонгированного действия для тромболитической терапии, полученный на основе иммобилизованного фибринолизина (стрептокиназы). В качестве водорастворимого полимера-носителя для иммобилизации стрептокиназы использован декстран с м.м. 60000, выпускаемый под названием полиглюкин. Предварительное активирование полиглюкина проводят калия периодатом при комнатной температуре и перемешивании раствора в течение 1 ч. Очистку окисленного полиглюкина от примесей осуществляют хроматографической адсорбцией. Для иммобилизации стрептокиназы к ее раствору приливают раствор окисленного полиглюкина с рН 8,7 и перемешивают в течение 1 ч. Аминогруппы стрептокиназы и альдегидные группы окисленного полиглюкина взаимодействуют с образованием азометиловой связи. Эту смесь охлаждают до 4 С. Последующее восстановление стрептодеказы проводят при добавлении к реакционной массе натрия боргидрата и перемешивании в течение 1 ч при 4С. Азометиловые связи между полимером и белком восстанавливаются, а избыток альдегидных групп полимера до гидроксильных. После определения фибринолитической активности раствор концентрируют методом ультрафильтрации. Концентрат стерилизуют методом фильтрации и подвергают сублимационной сушке.

Перспективным направлением является модификация полимерами гемоглобина человека с целью создания кровезаменителей с газотранспортной функцией. Основной целью исследований по применению растворов гемоглобина является получение такого препарата который бы имел повышенное сродство к кислороду, длительно не выводится из кровяного русла и не обладал бы групповыми и иммунными свойствами, характерными для крови. Таким образом, был разработан метод ковалентного присоединения водорастворимого сополимера винилпирролидона и аллилглицерилового эфира к молекуле гемоглобина, но исследования по использованию модифицированного гемоглобина в качестве кровезаменителя только начинают проводится на животных и еще далеки от клинического применения на больных.
2. Иммобилизация ферментов методом адсорбции.
Простейший и наиболее старый способ иммобилизации состоит в адсорбции фермента на твердом носителе неорганической (силикагель, окись алюминия, активированный уголь и т.п.) или органической (иониты, полисахариды и т.п.) природы.

Неорганические носители обладают хорошими механическими свойствами. Особенно удобны разработанные в последнее время пористые стекла и пористая керамика.

Имеется тенденция к всё большему применению в качестве матриц для адсорбции ферментов материалов, получаемых путем прививки одного полимера к другому.

Одним из методов широко практикуемой ныне иммобилизации дрожжевых/бактериальных клеток для получения этанола служит их сорбция за счет ионных сил на микропористой ионообменной смоле. Клетки дрожжей, адсорбированные на керамике и других носителях, обладают большей дыхательной активностью, чем свободные дрожжевые клетки.

В современных разработках прослеживается тенденция к использованию синтетических крупнопористых материалов, своеобразных «губок», впитывающих клеточную массу. Распространенным губчатым материалом служит полиуретан, образующий твердую «пену» с открытыми ячейками. Этот материал в виде мелко нарезанных частиц помещают в биореактор с клетками. Клетки, проникая в ячейки носителя, быстро растут. Такая система применяется при очистки сточных вод. Этот пример свидетельствует о простоте рассматриваемого метода иммобилизации. Она сводится к добавлению частиц носителя в перемешиваемую суспензию клеток или пропусканию такой суспензии через колонку с частицами носителя. Для иммобилизации без химической сшивки характерно слабое влияние носителя на свойства биокаталитической системы. Ферменты сохраняют свою природную активность, а клетки – жизнеспособность. В то же время непрочный характер связи носителя с ферментом ведет к их десорбции, снижающей надежность метода. Также к недостаткам данного способа относятся значительная неспецифическая сорбция посторонних веществ и часто недостаточно прочное удерживание фермента на носителе.

Относительно более прочными являются ионные взаимодействия, при которых адсорбция поддерживается при определенных рН и ионной силе омывающего раствора. Для ионной адсорбции применяют различные носители. Если необходимо регенерировать биокатализатор, то заменой раствора можно десорбировать фермент, т.е. взаимодействия биокатализатора и носителя могут быть поставлены под контроль технолога.

Однако взаимодействия между биокатализатором и носителем теряют прочность при высокой ионной силе раствора, например при получении аспарагиновой кислоты из фумарата аммония. В этих условиях надежнее адсорбция на принципах дисперсионных (гидрофобных) взаимодействий. Используемый для получения аспарагиновой кислоты фермент аспартазу адсорбируют на хлопчатобумажной ткани, к поверхности которой пришиты гидрофобные алкильные или арильные группы.
3. Иммобилизация ферментов путем включения в структуру геля.
Гели – структурированные коллоидные системы с жидкой дисперсионной средой, студенистые тела, механические свойства которых в большей или меньшей степени подобные механическим свойствам твердых тел. Частицы дисперсной фазы соединены между собой в рыхлую пространственную сетку, которая содержит в своих ячейках дисперсионную среду, лишая текучести систему в целом. Типичные гели образуются, например, при коагуляции золей, когда контакты между частицами легко и обратимо разрушаются при механических и тепловых воздействиях.

Гели с водной дисперсионной средой называются гидрогелями, с углеводородной – органогелями. Высушиванием гелей можно получить аэрогели – хрупкие микропористые тела, используемые как сорбенты и носители.

Большое распространение получил такой физический метод иммобилизации ферментов: включение их в различные полимерные гели. Суть метода состоит в том, что фермент вводят в раствор мономера и подходящего сшивающего реагента, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется трехмерная сетка геля, в ячейках которой «застревают» крупные молекулы фермента. В то же время для низкомолекулярных субстратов такой гель проницаем. Поэтому активность фермента по отношению к таким субстратам сохраняется, но в случае высокомолекулярных субстратов метод не пригоден.

При иммобилизации ферментов, необходимо чтобы активные группы матрицы не блокировали каталитический центр фермента, а условия иммобилизации не приводили к потере его активности. Определенные ограничения на способ иммобилизации налагает и особенности субстрата. В случае высокомолекулярных субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения ферментов в гель. Если матрица несет на себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетические параметры реакции: разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость реакции, катализируемой иммобилизованными ферментами, одноименные заряды ее снижают и могут быть причиной потери активности препарата.

Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и раствора. Ограниченная доступность субстрата к активному центру может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это характерно для высокомолекулярных субстратов, которые из-за малого коэффициента диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованных ферментов, что приводит к относительному увеличению скоростей других реакций с участием субстратов меньших размеров.

Наибольшее распространение получил метод включения ферментов в полиакриламидный гель. Фермент вводят в раствор акриламида и сшивающего реагента бис-акриламида, добавляют инициатор полимеризации, например тиосульфат аммония и получают гель с иммобилизованным ферментом, который обычно используют в виде гранул. Полимеризацию можно проводить и без инициатора под действием γ-излучения. Такой радиационно-химический метод имеет ряд преимуществ: система не загрязняется продуктами распада инициатора и можно обойтись без сшивающего реагента, т.к. сшивка полимерных цепей идет прямо под действием облучения. Кроме акриламидных гелей, используют гели поливинилового спирта, поливинилпирролидона, полиметакриловой кислоты и ряд других.

В последние годы широкое распространение получили методы привитой и конденсационной сополимеризации или, как их еще называют, «двойной иммобилизации».

В первом случае вначале проводят модификацию фермента каким-нибудь подходящим носителем (сефадекс, альгинат кальция, неорганические соли, природные полимеры, порошкообразные вещества), а затем этот комплекс сополимеризуют с другими носителями (полиакриламидный гель, целлюлоза, крахмал, сефароза). Таким способом были иммобилизованы химотрипсин, глюкозооксидаза и др.

При использовании метода конденсационной сополимеризации один из мономеров, например, акриламид, предварительно сополимеризуют с N – акрилоксидиамином и низкомолекулярным диамином (цистамин, триэтилентетрамин), а затем добавляют фермент и проводят дальнейшую полимеризацию. В смесь дополнительно могут быть добавлены и соответственно включены в гель субстраты, кофакторы, протекторы окисления и другие вещества. Удобство и применяемость описанного способа иммобилизации продемонстрированы на более чем 60 ферментах различных классов.

Интересна попытка, получить многослойную систему иммобилизованных ферментов, где слои фермента, чередуются со слоями инертного геля.

Таким образом, при использовании гелей для иммобилизации ферментов получают, как правило, препараты с хорошими механическим свойствами и высокой активностью, но такие препараты имеют ряд существенных недостатков, которые в значительной степени ограничивают возможность их практического применения, в частности в области медицины. К ним, прежде всего, относятся затрудненность диффузии субстрата в гель, невозможность использовать высокомолекулярные субстраты, а также серьезная проблема накопления больших количеств полимера в организме животных и человека при введении иммобилизованного в гель фермента в кровяное русло.

При внутривенном или внутрибрюшинном введении крысам аспарагиназы, включенной в полиакриламидный гель или метакрилатный гель, происходит снижение уровня аспарагина в крови, накопление частичек геля в клетках ретикуло-эндотелиальной системы, а также образование фиброзных пленок на поверхности геля. Описано применение метакрилатного геля с включением в него тромбина и карбоксипептидазы для остановки поверхностных кровотечений и инактивации продуктов интоксикации, вызванный этанолом. Исследуется возможность применения гемосовместимых гидрогелей на основе метакрилатных или метакрилоильных производных для покрытия внутренней поверхности искусственных кровеносных сосудов. Имеются также примеры успешного применения ферментов, включенных в гель, в медицинской биохимии. Так, в биохимических лабораториях для проявления электрофореграмм успешно используют ферменты, иммобилизованные в полиакриламидный гель: для проявления фосфоглюкомутазы применяют пленку, содержащую глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, а для пирофосфосфорилазы – пленку с глюкозо-6-фосфатгидрогеназой и фосфоглюкомутазой.

4. Иммобилизация ферментов методом микрокапсулирования.
Микрокапсулирование ферментов состоит во включении их водных растворов в полупроницаемые мембраны, не проницаемые для высокомолекулярных соединений и клеток, но через которые могут проникать низкомолекулярные вещества. Наличие ультратонкой мембраны позволяет создать высокие концентрации ферментов в малых объемах раствора, находящегося в микрокапсуле, и сохранить стабильность и биологическую активность инкапсулированных ферментов. Использование фермента в высоких концентрациях, а также большие значения отношения площади поверхности микрокапсул к их объему обеспечивают быструю диффузию низкомолекулярного субстрата из внешней среды к ферменту и продукта реакции из внутреннего объема микрокапсул в межкапсулярное пространство. Получены и исследованы микрокапсулированные формы целого ряда ферментов, катализирующих различные превращения низкомолекулярных субстратов. Так, микрокапсулированная каталаза, введенная внутривенно или внутрибрюшинно мышам с наследственным нарушением синтеза этого фермента, эффективно снижала содержание перборатов в крови и имела более длительный период жизни в организме, чем свободный фермент.

Идеальным материалом с точки зрения биологической утилизации микрокапсул в организме человека и животных могут быть различные природные мембраны клеток крови. Фермент при относительно мягких условиях может быть заключен в частично иммобилизованные клетки крови с последующим восстановлением целостности их мембран. Поскольку размер ферментных элементов крови мал, а время жизни их в кровяном русле относительно велико, такие микрокапсулы могут беспрепятственно и длительно циркулировать в крови. В форменные элементы крови включены такие ферменты, как β-глюкозидаза, β-галактозидаза и т.п. Все иммобилизованные в клетки крови ферменты имеют неизменяемые каталитические параметры и отличаются большей устойчивостью к повышению температур.

Применение микрокапсул, содержащих ферменты, экстракорпорально через шунты или камеры имеет хорошую перспективу. Одно из преимуществ состоит в том, что не происходит контакта фермента с иммунокомпетентными клетками, тем самым исключается возможность сенсибилизации организма со всеми неблагоприятными последствиями, кроме того, применение вне организма исключает накопление в нем искусственных клеток и снимает проблему разрушения и утилизации полимерных материалов. Благодаря ультратонкой полупроницаемой мембране с высоким значением отношения площади поверхности микрокапсул к их объему, скорость диффузии низкомолекулярных веществ через микрокапсулы выше, чем через диализную мембрану в аппарате искусственная почка. Принцип энзиматического превращения вредных метаболитов с помощью микрокапсулированных ферментов разрабатывается для применения в аппаратах искусственная почка и искусственная печень. Перспективным может оказаться использование микрокапсулированных ферментов для удаления мочевины – одного из самых токсичных метаболитов клетки. Одним из способов является превращение мочевины под действием микрокапсулированной уреазы в аммоний и диоксид углерода. Вторым – использование экстракорпорального шунта, снабженного микрокапсулами с мультиферментными рециркулирующими комплексами, с помощью таких микрокапсул благодаря сложной цепи рециркулирующих реакций, мочевина и аммоний превращаются в аминокислоты: глутамат, оксиглутамат, аланин.

Таким образом, из всего вышесказанного можно сделать вывод о том, что микрокапсулированный фермент имеет много преимуществ по сравнению с ферментом, находящимся в растворе. Повышается стабильность и соответственно срок действия микрокапсулированного фермента. Поэтому весьма важно для успешного практического использования микрокапсул, чтобы оболочка мембраны была легко проницаемой для низкомолекулярных субстратов и продуктов реакции, а также атромбогенной, биосовместимой и биодеградирующей.

Поиск материалов для формирования микрокапсул идет по двум направлениям:

1. 
   испытание синтетических материалов, часть из которых являются биодеградируемыми;
   
2. 
   испытание биодеградируемых природных материалов.
   

Синтетические материалы: нитрат целлюлозы, нейлон, полиакриламидный гель и др.

Из природных биодеградируемых материалов используются поперечно сшитые белки, нейтральные липиды, мембраны эритроцитов.

Использование микрокапсулированных ферментов можно осуществлять по двум направлениям:

1. 
   Введение интеркорпорально в кровяное русло;
   
2. 
   Применение в экстракорпоральных шунтах, когда через определенный объем микрокапсул перегоняется кровь больного человека (например, аппарат «искусственная почка»).
   

Методы получения микрокапсул подразделяются на три группы: физические (механические), физико-химические и химические.

Физические методы: к ним относятся методы механического нанесения оболочки на твердые и жидкие частицы лекарственного вещества.

Наиболее распространенными способами физического микрокапсулирования являются: дражирование, распыление, диспергирование, напыление в псевдоожиженном слое.

Получение микрокапсул методом диспергирования проводят с применением установки, представляющей собой котел с мешалкой и рубашкой.

В котел наливают подсолнечное масло и нагревают до 40 С. Желатин растворяют в воде с предварительным набуханием и нагреванием. Микрокапсулируемое вещество смешивают с полученным раствором желатина. Полученную смесь тонкой струей подают в реактор с работающей мешалкой. От скорости вращения зависит размер микрокапсул. Масло в реакторе охлаждают подачей в рубашку холодной воды. Микрокапсулы отделяют от масла процеживанием через капрон и промывают спиртом. Микрокапсулы сушат на воздухе 24 – 48 ч.

Получение микрокапсул методом диспергирования: в емкость наливают 1 % раствор МЦ и нагревают до 35 С. Масло какао расплавляют до жидкого состояния, вносят включаемое в оболочку вещество, получают суспензию. Суспензию тонкой струйкой при вращении мешалки подают в емкость. Резко охлаждают жидкость, помещая ее на лед. Полученная дисперсия может служить концентратом микрокапсул. Микрокапсулы можно также отделить, промывая микрокапсулы на сите холодной водой.

Физико-химические методы относятся к основным методам микрокапсулирования, основанные на явлении коацервации – явлении образования двухфазной системы, когда в результате расплавления одна фаза представляет собой раствор высокомолекулярного соединения в растворителе, другая – раствор растворителя в высокомолекулярном веществе. Снижению растворимости способствует изменение таких параметров системы, как температура, рН среды, ионная сила, число добавок к системе. Коацервация при взаимодействии раствора полимера и низкомолекулярного вещества называется простой. В ее основе лежит физико-химический механизм снижения растворения молекул и отделение воды от такого рода молекулярных слоев при помощи водоотнимающих средств.

Коацервация при взаимодействии двух полимеров называется комплексной (сложной), причем образование сложных коацерватов сопровождается взаимодействием между положительными и отрицательными зарядами молекул.

Химические методы микрокапсулирования основаны на реакциях полимеризации и поликонденсации на границе раздела двух несмешивающихся жидкостей. В результате междуфазной полимеризации мономеров на границе раздела дисперсионной среды (вода) и дисперсной фазы (масло) возникает твердая оболочка полимера, образующая шарообразную микрокапсулу, ядром которой могут быть растительные, животные, минеральные и синтетические масла, суспензии лекарственных веществ.

Пример получения микрокапсул данным методом: в масле растворяют лекарственное вещество. Мономер (метилметакрилат) и инициатор реакции полимеризации (перекись бензоила). Полученный раствор для возбуждения реакции полимеризации нагревают 15 – 20 мин при 55 С и вливают в водный раствор эмульгатора. При этом образуется эмульсия типа м/в, которую выдерживают для завершения процесса полимеризации в течение 4 ч. Полученный полиметилметакрилат, нерастворимый в масле образует вокруг капель последнего оболочку. Микрокапсулы отделяют, промывают и сушат.
5. Включение ферментов в волокна.
Фермент, включенный в волокно, может существовать в растворе, находясь непосредственно в окружении самого волокна – обычные волокна или в ограниченной его части (полой области) – полые волокна.

Для получения волокон первого типа различные полимеры (целлюлоза, нитроцеллюлоза и т.п.) растворяют в органическом растворителе, эмульгируют с раствором или суспензией фермента, затем смесь продавливают через мелкое сито. Образующиеся волокна представляют собой полимерные гели, которые содержат в своей структуре водный раствор фермента. На кинетические характеристики фермента, заключенного в волокна, оказывают существенное влияние диффузионные барьеры для субстрата и продукта реакции. Поэтому, как правило, уровень активности фермента, включенного в волокна, ниже, чем в нативном состоянии. С другой стороны, стабильность фермента, заключенного в волокно, выше, чем фермента в растворе. В настоящее время число различных ферментов, иммобилизованных в волокна, достигает более полусотни. Волокна успешно используют и для включения мультиферментных систем.

Волокна второго типа (полые волокна) изготовляются из природных или синтетических полимеров (поливинилхлорид, целлюлоза, полиакриламид и др.). Полые волокна состоят из основной массы полимерной матрицы, которая имеет внутреннюю полую область, контактирующую с полупроницаемой мембраной. Внешний и внутренний диаметры волокон составляют несколько сотен микрометров, толщина мембраны лежит в пределах десятых долей микрометра. Полая область волокна заполняется раствором фермента, который удерживается там за счет физической иммобилизации или химической связи между активными группами фермента и группами, находящимися на внутренней поверхности волокна. Полые волокна большого размера называются трубками. Каталитические свойства ферментов, включенных в волокна или трубки, используются в медицине в двух основных направлениях:

1. 
   в экстракорпоральных шунтах: при терапии различных субстрат-зависимых опухолей и для детоксикации организма при различных патологических состояниях;
   
2. 
   в ферментативных реакторах: при диагностических определениях концентрации метаболитов крови.
   

Максимальное внимание при разработке первоначального направления было уделено ферменту аспарагиназе, включенному в волокна из триацетата целлюлозы и дакрона. Присоединение экстракорпоральных шунтов, содержащую иммобилизованную в волокнах или трубках аспарагиназу, приводило к полному удалению аспарагина из кровяного русла животных.

Имеется попытка использовать полые волокна или трубки в качестве протезов сосудов.

При использовании иммобилизованных ферментов для удаления токсичных метаболитов было показано, что уреаза, включенная в волокна из триацетата целлюлозы, химически сшитая с помощью глутарового альдегида с нейлоновыми трубками, эффективно снижала уровень мочевины в крови у животных.

Имеются примеры успешного применения иммобилизованных в трубках или волокнах ферментов в медицине для диагностических целей. Использование клинического анализатора, оборудованного иммобилизованной на нейлоновых трубках уреазой, показало его высокую эффективность при непрерывном определении мочевины и цитруллина в сыворотке пациентов по сравнению с традиционно применяемыми биохимическими методами. Иммобилизованный фермент оставался стабильным в течение 4 мес. и дал возможность провести более 2000 определений.

В последние годы было установлено, что полые волокна, содержащие в своем составе микро- и ультрапористые мембраны, могут выполнять роль искусственных капиллярных подложек при культивировании клеточных культур млекопитающих. Реакторы, состоящие из таких волокон с соответствующими культурами, могут быть использованы как искусственные органы в виде экстракорпоральных шунтов, а также для наработки гормонов, вакцин, вирусов, вакцин и антител с целью терапевтического и диагностического их использования.

Было также показано, что мембраны полых волокон являются хорошими субстратами для роста микробных популяций. Разработка этой области может послужить основной для создания нового типа биореакторов, обладающих высокой эффективностью и длительным временем жизни.
6. Включение ферментов в липосомы.
Липосомы – искусственно полученные, замкнутые, сферические частицы, образованные бимолекулярными липидными слоями, чаще всего фосфолипидами, в пространстве, между которыми содержится среда формирования. Благодаря особенностям структуры, липосомы могут использоваться для доставки как гидрофильных (заключенных в водные бислои), так и гидрофобных (заключенные в липидные бислои) лекарственных веществ.

Липосомы впервые были открыты английским исследователем А. Бенхемом в начале 60-х гг. Фосфолипиды, имеющие гидрофильные и гидрофобные группировки, образуют в водных растворах при высокой концентрации замкнутые сферические бислойные структуры, внутрь которых могут быть заключены лекарственные вещества, что и легло в основу технологии липосом.

Структура липосом напоминает клеточную мембрану, поэтому липосомы являются физиологическим материалом, который организм может легко утилизировать, они легко проникают через различные физиологические барьеры и усиливают процесс адсорбции препарата в организме, заключенные внутрь липосом препараты не диффундируют, поэтому при введении таких препаратов не наблюдаются иммунные и другие системные реакции организма. Распадаются липосомы естественным путем, высвобождая заключенное в них лекарственное вещество. Таким образом, они обеспечивают контролируемое высвобождение лекарственного вещества и позволяют применять более высокие дозировки препаратов. Кроме того, липосомы имеют тенденцию накапливаться в определенных тканях (печени, селезёнки, лёгких и т.п.), что позволяет осуществлять целенаправленный транспорт лекарственных веществ к органам-мишеням.

Липосомы можно вводить как перорально, так и парентерально, при этом в большинстве случаев отмечено повышение терапевтического эффекта и пролонгированное действие лекарственных веществ, что обусловлено их задержкой в системе циркуляции и замедленным разрушением ферментами плазмы.

Фосфолипиды липосомальной мембраны используются организмом как компоненты клеточных мембран или вовлекаются в метаболизм. Наличие липидной мембраны, сходной по составу и структуре с цитоплазматической облегчает проникновение веществ в клетки посредством диффузии, слияния или эндоцитоза. Заключение лекарственных веществ в липосомы позволяет также снизить побочные действия токсичных препаратов. Кроме того, липосомы усиливают проникающую способность активных ингредиентов в кожу и, поэтому, перспективно их использование в дерматологии. Включают в липосомы хорошо известные препараты: протиопухолевые антибиотики, вакцины и ферменты.

Существуют различные методы приготовления липосом, позволяющие получать визикулы разного размера, состава, структуры и внутреннего объема. Выбор того или иного метода определяется целью работы, природой включенного биологически активного вещества и его расположением в липосомах (во внутреннем водном объеме или на липосомальной мембране).

Липосомы в зависимости от целей исследования готовят из фосфотидилхолина (яичный лецитин).

В лабораторных условиях возможно получение липосом из лецитина, выделенного из яичного желтка. В основе выделения лежит избирательное растворение лецитина в органических растворителях.

Получение яичного лецитина.

Яичные желтки тщательно отделяют от белка и гомогенизируют в течение 10 мин с 400 мл ацетона и оставляют в холодильнике на ночь. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Осадок вновь суспендируют с 400 мл ацетона и вновь отделяют центрифугированием. Осадок наносят тонким слоем на фильтровальную бумагу и высушивают до исчезновения запаха ацетона в течение 1 – 2 ч. Лецитин в ацетоне нерастворим, а другие липиды переходят в раствор.

Высушенный порошок заливают 200 мл смеси хлороформ-метанола (1:1) или хлороформ-этанола (2:1). Проводят экстрагирование при встряхивании на механической мешалке в течение 30 мин. Раствор центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Обработку осадка повторяют. Центрифугаты объединяют и выпаривают на роторном испарителе. После выпаривания смеси ФЛ растворяют в 50 мл петролейного эфира и добавляют 20 кратный объем ацетона, перемешивают и оставляют на ночь. Осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, растворяют в 50 мл петролейного эфира и повторяют осаждение. Полученную смесь растворяют в хлороформе, концентрируют до 10 – 20%.

Методы приготовления липосом.

Приготовление липосом методом ручного встряхивания.

100 мг хроматографически чистого лецитина растворяют в 50 мл хлороформа в колбе на 200 мл и присоединяют ее к роторному испарителю: при пониженном давлении проводят выпаривание органического растворителя, при этом на стенках колбы остается пленка сухого лецитина. 5 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора, рН 7,5, содержащего выше описанный материал вносят в колбу и оставляют на 1 – 2 ч при комнатной температуре для набухания фосфолипидов. Для образования гомогенной суспензии липосом в колбу вносят несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивают в течение 5 мин. Если взвесь озвучить при соблюдении следующих параметров процесса: частота – 20 кГц, мощность – 200 Вт, экспозиция – 30 мин, образуются очень мелкие, однородные по размеру липосомы. Данным методом можно вводить в липосомы низкомолекулярные вещества.

Приготовление липосом методом впрыскивания.

50 мг яичного лецитина растворяют в 1 мл 96 % этанола. Этанольный раствор липидов набирают в шприц и быстро вводят в 15 мл раствора вводимого материала (в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,5)). Полноценное образование липосом происходит при температуре водной фазы выше температуры фазового перехода фосфолипидов с постоянным перемешиванием на магнитной мешалке, игла шприца должна быть максимально погружена в водную фазу. Включается при этом 2,5 % материала, а для увеличения степени включения полученный препарат липосом перед отделением от не включившегося материала замораживают при температуре –20 – 40 С. Через 48 ч нагревают до комнатной температуры и производят отделение липосом от оставшегося материала. В результате замораживания и оттаивания материала увеличивается процент включения материала в 2,5 – 3,5 раза.

Приготовление липосом методом выпаривания и обращения фаз.

30 мг липидов растворяют в 3 мл эфира или смеси эфира с хлороформом (2:1) и вносят в круглодонную колбу роторного испарителя 1 мл раствора включаемого материала в 0,01 М фосфатном буфере с рН 7,5, добавляют в раствор липидов в органической фазе и обработкой ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт добиваются образования эмульсий типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю и постепенно уделяют органический растворитель. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновению запаха органического растворителя. Колбу снимают с испарителя, а к образовавшемуся гелю прибавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом. Липосомы характеризуются высокой степенью включения – до 50 – 60%.

Методы отделения липосом от не включиввшегося материала.

От не включившегося материала липосомы отделяют методом диализа. Диализ применяют для отделения липосом от не включившегося низкомолекулярного материала, молекулы которого способны проходить через диализную мембрану.

Суспензию липосом помещают в диализный целлофановый мешок. В качестве диализирующего раствора используют буфер, взятый для приготовления липосом в объеме, превышающем объем суспензии липосом в 50 – 100 раз. Диализ проводят на холоде (4 С). Для полного удаления буфера, не включающегося в липосомы материала достаточно 3 – 4 смен буфера.

Ультрацентрифугирование обеспечивает одновременное отделение не включившегося материала и концентрирование липосом. Недостатком данного метода является его продолжительность и трудоемкость.

Ультрафильтрация применяется с целью концентрирования взвеси липосом.

Методы контроля образования липосом.

Определение процента включения материала в липосомы проводят, используя количественные методы анализа действующих веществ. Для этой цели определяют содержание действующего начала в исходном веществе, взятого для включения в липосомы, содержимого липосом, а также не включающегося вещества. Не включающийся препарат отделяют от липосом методом диализа и оценивают количественно. Для определения содержания вещества в липосомах их предварительно разрушают детергентами – тритоном Х-100 до 0,5 – 1 % концентрации. Если включенный в липосомы материал не инактивируется хлороформом, то липосомальный препарат обрабатывают хлороформом. Температура среды 4 С. К 4 объемам взвеси липосом добавляют один объем хлороформа и интенсивно встряхивают в течение 5 мин.

По величине содержания действующего вещества в липосомах рассчитывают процент включения вещества, к общему количеству взятого в опыт.