БХ 2 занятие. 1. Физикохимические свойства белков
 Скачать 86.37 Kb.
|
|
1. Физико-химические свойства белков в связи со структурными особенностями. Факторы стабилизации белковых растворов (структурная организация, наличие заряда, наличие гидратной оболочки). 2. Способы осаждения белков (обратимые – высаливание, изоэлектрическое осаждение; необратимые - денатурация). Практическое применение. 3. Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация) 4. Хроматографические методы разделения белков (гель-хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, адсорбционная хроматография). Принципы методов. Практическое применение. 5. Электрофорез белков сыворотки крови. Принцип, диагностическое значение. Особенности протеинограммы в детском возрасте. Диагностическое значение метода. 6. Метод количественного определения белка в сыворотке крови (практика). Принцип, норма, диагностическое значение. 1.Физико-химические свойства белков: Различия белков по форме молекул. Глобулярные белки имею более компактную форму, их гидрофобный радикал спрятан в гидрофобное ядро. Поэтому они значительно лучше растворимы в организме чем фибриллярные (исключение: мембранные белки). Различия белков по молекулярной массе. Колебание происходит от 6000до 1 000 000 Д или выше. Масса зависит от количества аминокислотных остатков. Для олигомерных белков – от количества протомеров (субъединиц). Суммарный заряд белков. Белки, содержащие в своем составе катионные радикалы (Лиз, Арг, Гис) и анионные (Глу, Асп), содержащие функциональные группы, способны к ионизации (ионогенные группы). Суммарный заряд зависит от отношения катионных и анионных радикалов. На –N, -C концах есть α-амино-, α-карбоксильная группы, способные к ионизации. Степень ионизации зависит от pH среды.: При pH около 7, все ионогенные группы находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (H+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшение отрицательного заряда белка: -COO- + H+ = -COOH. В щелочной среде Связывание избытка OH- и протонами, образующимися при диссоциации NH3+ с образование воды, приводит к уменьшению положительного заряда: -NH3+ + OH- = -NH2 + H2O Значение pH, при котором заряд равен 0, называют изоэлектрическая точка (pI). Если в белке содержится больше анионогенных групп (-COO-), то изоэлектрическая точка находится в слабокислой среде. Если больше катионогенных групп, то в щелочной. Белки, имеющие какой-либо заряд, лучше растворимы, чем изоэлетрические белки. Т.к. заряд увеличивает количество диполей воды, способные связываться с молекулой, и препятствуют контакту одноимённо заряженных молекул => увеличивается растворимость. Так же заряженные белки могут двигаться в электрическом поле Соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нативных молекул белков. На поверхности внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных радикалов различно у разных белков. Олигомеры протомереных белков в месте контакта имеют гидрофобные радикалы. Поверхность белков, функционирующих в мембране или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также имеют гидрофорбные радикалы. Они лучше растворяются в липидах. Растворимость белков. Растворимость белка зависит от всех его свойств и определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворенных веществ. Факторы: Заряд белковой молекулы. На поверхности белковой молекулы имеются как положительно, так и отрицательно заряженные радикалы аминокислот. Количество этих групп, следовательно, и суммарный заряд белков зависят от рН среды. Значение рН, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ количество положительно и отрицательно заряженных групп одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии. Величина заряда белков - один из факторов, увеличивающий их растворимость. При потере заряда в изоэлектрической точке белки легче агрегируют и выпадают в осадок. Это особенно характерно для денатурированных белков, у которых на поверхности появляются гидрофобные радикалы аминокислот. Гидратная оболочка - это слой молекул воды, ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами.  Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Вода гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, а связана с белковой молекулой. Это - “связанная” вода. Она принадлежит белку, и поэтому имеет особые свойства:Температура кипения выше 1000С. Температура замерзания ниже 0ОС. В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества. Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок. При удалении гидратной оболочки белков происходит коагуляция, т.е. склеивание белковых частиц и выпадение их в осадок. Для этого достаточно изменить структуру частицы белка, так, чтобы ее гидрофильные группы, которые связывают воду растворителя, оказались внутри частицы. Чтобы осадить белок из раствора, надо лишить его обоих факторов стабилизации: и заряда, и гидратной оболочки. Чтобы сохранить нативность белковой молекулы, ее заряд можно устранить только одним способом: приблизить рН среды к изоэлектрической точке белка (ИЭТ), а для большинства белков нашего организма ИЭТ находится в слабокислой среде. Другой фактор стабилизации - гидратную оболочку можно устранить разными способами. 2. Способы осаждение белка: Обратимые Высаливание - это осаждение белков высокими концентрациями нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов, поскольку такие соли очень гидрофильны и обладают в высоких концентрациях водоотнимающими свойствами. Чаще это NaCl, Na2SO4, (NH4)2SO4, CaCl2. По мере добавления таких солей к раствору белка они сначала растворяюся в свободной воде, а затем, при дальнейшем повышении концентрации соли, конкурируют с белком за обладание водой, которая входит в состав гидратных оболочек. Белки менее гидрофильные, которые плохо удерживают воду гидратной оболочки, теряют ее раньше. Более гидрофильные белки требуют большей концентрации соли для высаливания. Поэтому с помощью высаливания можно разделить белки с разной степенью гидрофильности. Таким способом, например, можно разделить альбумины и глобулины плазмы крови. Применение водоотнимающих свердств. Такими средствами являются растворители, которые смешиваются с водой в любых соотношениях. Чаще всего это ацетон, этиловый спирт. Эти вещества отнимают гидратные оболочки белков, и белки выпадают в осадок, если они лишены заряда. Но, в отличие от высаливания, осадок сразу (немедленно!) должен быть отделен от растворителя. Если растворитель и белок будут длительно находиться в контакте, то могут произойти необратимые изменения структуры белковой молекулы (денатурация). Необратимые Денатурация белков - это разрушение их нативной конформации, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственные структуры, при действии денатурирующих агентов. Денатурация сопровождается потерей биологической активности белка. Уникальная трехмерная структура каждого белка разрушается, и все молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, т.е. отличную от других таких же молекул. Радикалы аминокислот, формирующие активный центр белка, оказываются пространственно удаленными друг от друга, т.е. разрушается специфический центр связывания белка с лигандом. Гидрофобные радикалы, обычно находящиеся в гидрофобном ядре глобулярных белков, при денатурации оказываются на поверхности молекулы, тем самым создаются условия для агрегации белков. Агрегаты белков выпадают в осадок. При денатурации белков не происходит разрушения их первичной структуры. 3. Методы очистки: Диализ — освобождение растворов высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощи полупроницаемой мембраны, т. е. перегородки. Диализ известен нам как "избирательная диффузия". Избирательная диффузия - это диффузия (перемещение веществ от высокой концентрации к более низкой сквозь полупроницаемую мембрану), в процессе которой, в зависимости от мембраны, некоторые вещества будут проникать сквозь мембрану, а некоторые - нет. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через мембрану, а неспособные диализировать (проходить через мембрану) частицы остаются за ней. Простейший диализатор представляет собой мешочек из полупроницаемого материала, в котором находится диализируемая (очищаемая) жидкость. Мембраны делают из коллодия, целлофана, животных и растительных перепонок, синтетических материалов и др. Мешочек погружают в растворитель, например в воду. Постепенно концентрации низкомолекулярного вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа обычно крайне низка (недели) (диффузия). Диализ применяют для устранения из растворов белка и ДНК нежелательных низкомолекулярных примесей или замены состава этих растворов. Его также применяют для очистки коллоидных растворов от примесей электролитов и низкомолекулярных неэлектролитов. Диализ применяют в промышленности для очистки различных веществ, например в производстве искусственных волокон, при изготовлении лекарственных веществ. Материал, прошедший через мембрану, называется диализат. Ультрафильтрация, продавливание жидкости через полупроницаемую мембрану — проницаемую для малых молекул и ионов, но непроницаемую для макромолекул и коллоидных частиц. Вода и малые молекулы проходят через мембрану, а по другую сторону мембраны остается концентрированный раствор белка. Это достигается в специальных ячейках (объемом до 1 л) с перемешиванием раствора и с применением сжатого инертного газа. Этот же принцип лежит в основе ультрафильтрации на полых волокнах, используемых для концентрирования больших объемов растворов. Ультрафильтрацию растворов, содержащих молекулы высокомолекулярных соединений, иногда называют молекулярной фильтрацией. Ультрафильтрацию можно рассматривать как диализ под давлением или как обратный осмос, если мембрана пропускает только молекулы растворителя. В последнем случае процесс часто называют гиперфильтрацией; при его осуществлении внешнее давление должно превышать осмотическое давление раствора. Мембраны для ультрафильтров, обычно в виде пластин (листов) или цилиндрических патронов («свечей»), изготавливают из микропористых неорганических материалов, продуктов животного происхождения, но чаще из искусственных и синтетических полимеров (эфиров целлюлозы, полиамидов и др.). Максимальный размер проходящих через мембрану частиц (молекул) лежит в пределах от нескольких мкм до сотых долей мкм.Разделяющая способность (селективность) мембран зависит от их структуры и физико-химических свойств, а также от давления, температуры, состава фильтруемой жидкости и прочих внешних факторов. Ультрафильтрация как метод концентрирования, очистки и фракционирования высокодисперсных систем и многокомпонентных растворов широко применяется в лабораторной практике, медицине, промышленности. Так, посредством ультрафильтрации очищают от ионных и не ионных примесей воду, органические растворители, жидкие топлива и масла; разделяют сложные смеси белков, алкалоидов и др. веществ; выделяют ферменты, витамины, вирусы; стерилизуют жидкости медицинского и фармацевтического назначения. Типичные примеры применения ультрафильтрации: Концентрирование и очистка растворов белков, аминокислот; Удаление солей из препаратов РНК и ДНК; Удаление праймеров из ПЦР амплипированных ДНК; Удаление ферментов из препаратов ДНК перед клонированием; Удаление меченых аминокислот и нуклеотидов; Удаление белка из образцов; Подготовка образцов для ВЭЖХ; Очистка антител и гормонов из биологических жидкостей и ферментационных бульонов. 4. Хроматографические методы разделения белков:  Гель-фильтрационная хроматография. Основан(метод) на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул. Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.
Ионообменная хроматография. Так же, как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Р  азличают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например, карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы. Аффинная хроматография, или хроматография по сродству.  Основан на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз. Адсорбционная хроматография– метод хроматографии, в основе которого лежит многократное перераспределение молекул анализируемого вещества (сорбата) между подвижной фазой и поверхностью твердого сорбента в результате актов адсорбции и десорбции этих молекул. Если адсорбционные свойства компонентов хроматографируемой смеси различны, то при движении элюента через сорбент происходит разделение компонентов. В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования π-комплексов или комплексов с переносом заряда. Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик вещества симметричен и время удерживания не зависит от размера пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую форму, что приводит к некоторой асимметрии пика с образованием хвоста. 5. Электрофорез белков сыворотки крови. Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-). Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам. Р  азрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе. Особенности протеинограммы в детском возрасте. У новорожденных содержание общего белка в сыворотке крови значительно ниже, чем у взрослых, и становится минимальной к концу первого месяца жизни (48 г/л). Ко второму, третьему годам жизни общий белок повышается до уровня взрослых. В течение первых месяцев жизни концентрация глобулиновых фракций низка, что при- водит к относительной гиперальбуминемии до 66-76%. Между вторым и двенадцатым месяцами возникает временное превышение концентрацией α2-глобулинов взрослого уровня. Количество фибриногена при рождении гораздо ниже, чем у взрослых (около 2,0 г/л), но к концу первого месяца достигает обычной нормы (4,0 г/л). 6.Количественный анализ белков Для количественного определения белков в биологическом материале или лекарственных препаратах чаще всего употребляются азотометрия, фотоколориметрия, фотонефелометрия и спектрофотометрия. Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. Поскольку белки содержат в среднем 16% азота, то найденное количество его умножают на 6,25 (так как 100:16=6,25) и получают содержание белка в пробе. Эти методы (к ним относится классический метод Кьельдаля и его модификации) очень трудоемки и не всегда надежны, так как процентное содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19. Фотоколориметрическиеметоды основаны на так называемых «цветных» реакциях на функциональные группы белков. Среди них наибольшее применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот (тирозин, триптофан). Биуретовый метод более специфичен, так как пептидные связи имеются только в белках и пептидах. Он широко применяется в клинико-биохимических исследованиях. Метод Лоури, основанный на реакции Фолина, высокочувствительный, но малоспецифичный, поскольку сходную окраску дают свободные ароматические аминокислоты и многие другие соединения, содержащие фенольную группу. Фотонефелометрические методы определения содержания белка основываются на оценке степени мутности его взвеси в растворах. Эти методы не получили широкого распространения. Спектрофотометрические методы делятся на прямые и косвенные. Последние представляют собой боле чувствительный и точный вариант фотоколориметрического. После проведения цветной реакции на белки проводят спектрофотометрию окрашенного раствора и по светопоглощению его в монохроматическом свете рассчитывают содержание белка. Прямой метод состоит в измерении светопоглощения раствора белка в ультрафиолетовой области при 200-220 нм (в этой области абсорбируют пептидные группы белка) и при 280 нм (зона поглощения ароматических радикалов аминокислот, в основном триптофана и тирозина). Эти методы весьма удобны и не требуют предварительного образования окрашенных комплексов. Более специфична спектрофотометрия при 200-220 нм, чем при 280 нм, так как в последнем случае мешает светопоглощение различных низкомолекулярных ароматических соединений, содержащихся в биологическом материале. Биуретовый метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu2+ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде. Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график. Для этого применяют стандартный белок – кристаллический альбумин сыворотки крови.
Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием. Через 30 мин измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый). По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс – концентрацию белка. Берут 2 пробирки – в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием. Через 30 мин измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора. Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой. Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на светопоглощении при 280 нм ароматических радикалов тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина, содержащихся в белке. Однако при данной длине волны поглощают и нуклеиновые кислоты, хотя их максимум абсорбции приходится на 260 нм. Поэтому измерение экстинкции раствора проводят при 260 и 280 нм, чтобы сделать поправку на примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Метод неприменим к материалу, где содержание нуклеиновой кислоты превышает 20%. Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и добавляют 9,9 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой. Измеряют экстинкцию исследуемого раствора против контрольного раствора хлорида натрия на спектрофотометре в кювете толщиной 1 см при двух длинах волн – 260 и 280 нм. Расчет можно проводить по формуле, эмпирически полученной Калькаром (поэтому можно не прибегать к калибровочному графику): х = 1,45Е280 – 0,74Е260, где х – концентрация белка в растворе, г/л. |