бх. БХ 2 занятие. 1. Физикохимические свойства белков
 Скачать 86.37 Kb.
|
1 2 1. Физико-химические свойства белков в связи со структурными особенностями. Факторы стабилизации белковых растворов (структурная организация, наличие заряда, наличие гидратной оболочки). 2. Способы осаждения белков (обратимые – высаливание, изоэлектрическое осаждение; необратимые - денатурация). Практическое применение. 3. Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация) 4. Хроматографические методы разделения белков (гель-хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, адсорбционная хроматография). Принципы методов. Практическое применение. 5. Электрофорез белков сыворотки крови. Принцип, диагностическое значение. Особенности протеинограммы в детском возрасте. Диагностическое значение метода. 6. Метод количественного определения белка в сыворотке крови (практика). Принцип, норма, диагностическое значение. 1.Физико-химические свойства белков: Различия белков по форме молекул. Глобулярные белки имею более компактную форму, их гидрофобный радикал спрятан в гидрофобное ядро. Поэтому они значительно лучше растворимы в организме чем фибриллярные (исключение: мембранные белки). Различия белков по молекулярной массе. Колебание происходит от 6000до 1 000 000 Д или выше. Масса зависит от количества аминокислотных остатков. Для олигомерных белков – от количества протомеров (субъединиц). Суммарный заряд белков. Белки, содержащие в своем составе катионные радикалы (Лиз, Арг, Гис) и анионные (Глу, Асп), содержащие функциональные группы, способны к ионизации (ионогенные группы). Суммарный заряд зависит от отношения катионных и анионных радикалов. На –N, -C концах есть α-амино-, α-карбоксильная группы, способные к ионизации. Степень ионизации зависит от pH среды.: При pH около 7, все ионогенные группы находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (H+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшение отрицательного заряда белка: -COO- + H+ = -COOH. В щелочной среде Связывание избытка OH- и протонами, образующимися при диссоциации NH3+ с образование воды, приводит к уменьшению положительного заряда: -NH3+ + OH- = -NH2 + H2O Значение pH, при котором заряд равен 0, называют изоэлектрическая точка (pI). Если в белке содержится больше анионогенных групп (-COO-), то изоэлектрическая точка находится в слабокислой среде. Если больше катионогенных групп, то в щелочной. Белки, имеющие какой-либо заряд, лучше растворимы, чем изоэлетрические белки. Т.к. заряд увеличивает количество диполей воды, способные связываться с молекулой, и препятствуют контакту одноимённо заряженных молекул => увеличивается растворимость. Так же заряженные белки могут двигаться в электрическом поле Соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нативных молекул белков. На поверхности внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных радикалов различно у разных белков. Олигомеры протомереных белков в месте контакта имеют гидрофобные радикалы. Поверхность белков, функционирующих в мембране или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также имеют гидрофорбные радикалы. Они лучше растворяются в липидах. Растворимость белков. Растворимость белка зависит от всех его свойств и определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворенных веществ. Факторы: Заряд белковой молекулы. На поверхности белковой молекулы имеются как положительно, так и отрицательно заряженные радикалы аминокислот. Количество этих групп, следовательно, и суммарный заряд белков зависят от рН среды. Значение рН, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ количество положительно и отрицательно заряженных групп одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии. Величина заряда белков - один из факторов, увеличивающий их растворимость. При потере заряда в изоэлектрической точке белки легче агрегируют и выпадают в осадок. Это особенно характерно для денатурированных белков, у которых на поверхности появляются гидрофобные радикалы аминокислот. Гидратная оболочка - это слой молекул воды, ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами. Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Вода гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, а связана с белковой молекулой. Это - “связанная” вода. Она принадлежит белку, и поэтому имеет особые свойства:  Температура кипения выше 1000С. Температура замерзания ниже 0ОС. В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества. Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок. При удалении гидратной оболочки белков происходит коагуляция, т.е. склеивание белковых частиц и выпадение их в осадок. Для этого достаточно изменить структуру частицы белка, так, чтобы ее гидрофильные группы, которые связывают воду растворителя, оказались внутри частицы. Чтобы осадить белок из раствора, надо лишить его обоих факторов стабилизации: и заряда, и гидратной оболочки. Чтобы сохранить нативность белковой молекулы, ее заряд можно устранить только одним способом: приблизить рН среды к изоэлектрической точке белка (ИЭТ), а для большинства белков нашего организма ИЭТ находится в слабокислой среде. Другой фактор стабилизации - гидратную оболочку можно устранить разными способами. 2. Способы осаждение белка: Обратимые Высаливание - это осаждение белков высокими концентрациями нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов, поскольку такие соли очень гидрофильны и обладают в высоких концентрациях водоотнимающими свойствами. Чаще это NaCl, Na2SO4, (NH4)2SO4, CaCl2. По мере добавления таких солей к раствору белка они сначала растворяюся в свободной воде, а затем, при дальнейшем повышении концентрации соли, конкурируют с белком за обладание водой, которая входит в состав гидратных оболочек. Белки менее гидрофильные, которые плохо удерживают воду гидратной оболочки, теряют ее раньше. Более гидрофильные белки требуют большей концентрации соли для высаливания. Поэтому с помощью высаливания можно разделить белки с разной степенью гидрофильности. Таким способом, например, можно разделить альбумины и глобулины плазмы крови. Применение водоотнимающих свердств. Такими средствами являются растворители, которые смешиваются с водой в любых соотношениях. Чаще всего это ацетон, этиловый спирт. Эти вещества отнимают гидратные оболочки белков, и белки выпадают в осадок, если они лишены заряда. Но, в отличие от высаливания, осадок сразу (немедленно!) должен быть отделен от растворителя. Если растворитель и белок будут длительно находиться в контакте, то могут произойти необратимые изменения структуры белковой молекулы (денатурация). Необратимые Денатурация белков - это разрушение их нативной конформации, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственные структуры, при действии денатурирующих агентов. Денатурация сопровождается потерей биологической активности белка. Уникальная трехмерная структура каждого белка разрушается, и все молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, т.е. отличную от других таких же молекул. Радикалы аминокислот, формирующие активный центр белка, оказываются пространственно удаленными друг от друга, т.е. разрушается специфический центр связывания белка с лигандом. Гидрофобные радикалы, обычно находящиеся в гидрофобном ядре глобулярных белков, при денатурации оказываются на поверхности молекулы, тем самым создаются условия для агрегации белков. Агрегаты белков выпадают в осадок. При денатурации белков не происходит разрушения их первичной структуры. 3. Методы очистки: Диализ — освобождение растворов высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощи полупроницаемой мембраны, т. е. перегородки. Диализ известен нам как "избирательная диффузия". Избирательная диффузия - это диффузия (перемещение веществ от высокой концентрации к более низкой сквозь полупроницаемую мембрану), в процессе которой, в зависимости от мембраны, некоторые вещества будут проникать сквозь мембрану, а некоторые - нет. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через мембрану, а неспособные диализировать (проходить через мембрану) частицы остаются за ней. Простейший диализатор представляет собой мешочек из полупроницаемого материала, в котором находится диализируемая (очищаемая) жидкость. Мембраны делают из коллодия, целлофана, животных и растительных перепонок, синтетических материалов и др. Мешочек погружают в растворитель, например в воду. Постепенно концентрации низкомолекулярного вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа обычно крайне низка (недели) (диффузия). Диализ применяют для устранения из растворов белка и ДНК нежелательных низкомолекулярных примесей или замены состава этих растворов. Его также применяют для очистки коллоидных растворов от примесей электролитов и низкомолекулярных неэлектролитов. Диализ применяют в промышленности для очистки различных веществ, например в производстве искусственных волокон, при изготовлении лекарственных веществ. Материал, прошедший через мембрану, называется диализат. Ультрафильтрация, продавливание жидкости через полупроницаемую мембрану — проницаемую для малых молекул и ионов, но непроницаемую для макромолекул и коллоидных частиц. Вода и малые молекулы проходят через мембрану, а по другую сторону мембраны остается концентрированный раствор белка. Это достигается в специальных ячейках (объемом до 1 л) с перемешиванием раствора и с применением сжатого инертного газа. Этот же принцип лежит в основе ультрафильтрации на полых волокнах, используемых для концентрирования больших объемов растворов. Ультрафильтрацию растворов, содержащих молекулы высокомолекулярных соединений, иногда называют молекулярной фильтрацией. Ультрафильтрацию можно рассматривать как диализ под давлением или как обратный осмос, если мембрана пропускает только молекулы растворителя. В последнем случае процесс часто называют гиперфильтрацией; при его осуществлении внешнее давление должно превышать осмотическое давление раствора. Мембраны для ультрафильтров, обычно в виде пластин (листов) или цилиндрических патронов («свечей»), изготавливают из микропористых неорганических материалов, продуктов животного происхождения, но чаще из искусственных и синтетических полимеров (эфиров целлюлозы, полиамидов и др.). Максимальный размер проходящих через мембрану частиц (молекул) лежит в пределах от нескольких мкм до сотых долей мкм.Разделяющая способность (селективность) мембран зависит от их структуры и физико-химических свойств, а также от давления, температуры, состава фильтруемой жидкости и прочих внешних факторов. Ультрафильтрация как метод концентрирования, очистки и фракционирования высокодисперсных систем и многокомпонентных растворов широко применяется в лабораторной практике, медицине, промышленности. Так, посредством ультрафильтрации очищают от ионных и не ионных примесей воду, органические растворители, жидкие топлива и масла; разделяют сложные смеси белков, алкалоидов и др. веществ; выделяют ферменты, витамины, вирусы; стерилизуют жидкости медицинского и фармацевтического назначения. Типичные примеры применения ультрафильтрации: Концентрирование и очистка растворов белков, аминокислот; Удаление солей из препаратов РНК и ДНК; Удаление праймеров из ПЦР амплипированных ДНК; Удаление ферментов из препаратов ДНК перед клонированием; Удаление меченых аминокислот и нуклеотидов; Удаление белка из образцов; Подготовка образцов для ВЭЖХ; Очистка антител и гормонов из биологических жидкостей и ферментационных бульонов. 4. Хроматографические методы разделения белков: Гель-фильтрационная хроматография.  Основан(метод) на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул. Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.
1 2 |