бх. БХ 2 занятие. 1. Физикохимические свойства белков
 Скачать 86.37 Kb.
|
1 2 Ионообменная хроматография. Так же, как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например, карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.  Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Основан на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.  Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз. Адсорбционная хроматография– метод хроматографии, в основе которого лежит многократное перераспределение молекул анализируемого вещества (сорбата) между подвижной фазой и поверхностью твердого сорбента в результате актов адсорбции и десорбции этих молекул. Если адсорбционные свойства компонентов хроматографируемой смеси различны, то при движении элюента через сорбент происходит разделение компонентов. В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования π-комплексов или комплексов с переносом заряда. Изотермы адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При линейной изотерме адсорбции пик вещества симметричен и время удерживания не зависит от размера пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую форму, что приводит к некоторой асимметрии пика с образованием хвоста. 5. Электрофорез белков сыворотки крови. Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-). Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам. Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.  Особенности протеинограммы в детском возрасте. У новорожденных содержание общего белка в сыворотке крови значительно ниже, чем у взрослых, и становится минимальной к концу первого месяца жизни (48 г/л). Ко второму, третьему годам жизни общий белок повышается до уровня взрослых. В течение первых месяцев жизни концентрация глобулиновых фракций низка, что при- водит к относительной гиперальбуминемии до 66-76%. Между вторым и двенадцатым месяцами возникает временное превышение концентрацией α2-глобулинов взрослого уровня. Количество фибриногена при рождении гораздо ниже, чем у взрослых (около 2,0 г/л), но к концу первого месяца достигает обычной нормы (4,0 г/л). 6.Количественный анализ белков Для количественного определения белков в биологическом материале или лекарственных препаратах чаще всего употребляются азотометрия, фотоколориметрия, фотонефелометрия и спектрофотометрия. Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. Поскольку белки содержат в среднем 16% азота, то найденное количество его умножают на 6,25 (так как 100:16=6,25) и получают содержание белка в пробе. Эти методы (к ним относится классический метод Кьельдаля и его модификации) очень трудоемки и не всегда надежны, так как процентное содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19. Фотоколориметрическиеметоды основаны на так называемых «цветных» реакциях на функциональные группы белков. Среди них наибольшее применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот (тирозин, триптофан). Биуретовый метод более специфичен, так как пептидные связи имеются только в белках и пептидах. Он широко применяется в клинико-биохимических исследованиях. Метод Лоури, основанный на реакции Фолина, высокочувствительный, но малоспецифичный, поскольку сходную окраску дают свободные ароматические аминокислоты и многие другие соединения, содержащие фенольную группу. Фотонефелометрические методы определения содержания белка основываются на оценке степени мутности его взвеси в растворах. Эти методы не получили широкого распространения. Спектрофотометрические методы делятся на прямые и косвенные. Последние представляют собой боле чувствительный и точный вариант фотоколориметрического. После проведения цветной реакции на белки проводят спектрофотометрию окрашенного раствора и по светопоглощению его в монохроматическом свете рассчитывают содержание белка. Прямой метод состоит в измерении светопоглощения раствора белка в ультрафиолетовой области при 200-220 нм (в этой области абсорбируют пептидные группы белка) и при 280 нм (зона поглощения ароматических радикалов аминокислот, в основном триптофана и тирозина). Эти методы весьма удобны и не требуют предварительного образования окрашенных комплексов. Более специфична спектрофотометрия при 200-220 нм, чем при 280 нм, так как в последнем случае мешает светопоглощение различных низкомолекулярных ароматических соединений, содержащихся в биологическом материале. Биуретовый метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu2+ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде. Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график. Для этого применяют стандартный белок – кристаллический альбумин сыворотки крови.
Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием. Через 30 мин измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый). По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс – концентрацию белка. Берут 2 пробирки – в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием. Через 30 мин измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора. Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой. Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на светопоглощении при 280 нм ароматических радикалов тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина, содержащихся в белке. Однако при данной длине волны поглощают и нуклеиновые кислоты, хотя их максимум абсорбции приходится на 260 нм. Поэтому измерение экстинкции раствора проводят при 260 и 280 нм, чтобы сделать поправку на примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Метод неприменим к материалу, где содержание нуклеиновой кислоты превышает 20%. Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и добавляют 9,9 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой. Измеряют экстинкцию исследуемого раствора против контрольного раствора хлорида натрия на спектрофотометре в кювете толщиной 1 см при двух длинах волн – 260 и 280 нм. Расчет можно проводить по формуле, эмпирически полученной Калькаром (поэтому можно не прибегать к калибровочному графику): х = 1,45Е280 – 0,74Е260, где х – концентрация белка в растворе, г/л. 1 2 |