ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВ. Ферментативная активность почв
 Скачать 34.97 Kb.
|
|
| Степень обеспечен ности почвы | Каталаза. см* Oj на 1 г почвы за 1 мин | Дегидроге наза. мгТФФ на 10 г почвы за 24 ч. | Инвертаза. мг глюкозы на 1 г почвы за 24 ч. | Уреаза. мг NHjна Юг почвы за 24 ч. | Фосфатаза. мг PjOj на 10 г поч вы за 24 ч. |
| Очень бедная | < 1 | < 1 | <5 | <3 | <0.5 |
| Бедная | 1-3 | 1-3 | 5-15 | 3-10 | 0.5- 1.5 |
| Срсднеобо- гашенная | 3-10 | 3-10 | 15-50 | 10-30 | 1.5-5.0 |
| Богатая | 10-30 | 10-30 | 50 - 150 | 30-100 | 5.0-15 |
| Очень богатая | >30 | >30 | > 150 | > 100 | > 15 |
За основу определения ферментов в почве взяты методы, описан ные А.Ш. Галстяном (1974). В настоящем издании приведены методики определения активности ферментов дегидрогеназы, нитрат-, нитрит- редуктазы, феррирсдуктазы, сульфатредуктазы. МпСЬ-редуктазы, усовер шенствованные и модифицированные сотрудницей кафедры агрохимии МГУ Н.Ф. Гомоновой.
ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ
Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов и в почве.
Активность окислительно-восстановительных ферментов находит ся в корреляционной зависимости с основными физико-химическими свойствами, микробиологическими процессами в почве, нитрификацией, сульфофикацией.
Катализа (Н202: НгОгОксидоредуктаза. КФ 1.111.6)
Катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: 2 Н70: >2 НгО + 03
Перекись водорода образуется в процессе дыхания растений и в результате биохимических реакций окисления органических веществ.
Роль каталазы в почве заключается в разрушении ядовитой для растений перекиси водорода.
Методы определения каталазной активности почв основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии ее с почвой.
Гизометрический метод определения активности катализы
Ход анализа
Навеску почвы I г вносят в толстостенную колбу или склянку емкостью 100 см\ добавляют 0,5 г СаСО;. Осторожно на дно колбы ставят пинцетом маленький стаканчик с 5 см3 3% раствора перекиси водорода (1). Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой, имеющей трубку, соединенную каучуковым шлангом через тройник (2), снабженный зажимом или краном, с бюреткой. Последняя сообщается с грушей (3). Бюретка и груша заполнены водой. Уровень воды в бюретке (4) и груше уравновешивают и последнюю закрепляют на определенной высоте. Закрывают кран, устраняя сообщение прибора с внешней средой. Следят, чтобы уровень воды в бюретке не менялся, что свидетельствует о достижении температурного равновесия в приборе и комнате (рис. 24).
Начало опыта отмечают по секундомеру в тот момент, когда стаканчик с перекисью водорода опрокидывается и вслед за этим встряхивается содержимое колбы. Взбалтывание смеси продолжают во все время опыта, не касаясь непосредственно колбы руками. Выделяющийся кислород вытесня ет из бюретки воду, уровень которой фиксируют.
Количество выделившегося молекулярного кислорода учитыва ют при температуре 18 - 20°С в течение I -2 мин.
Дегидрогеназы - ферменты, участвующие в процессе дыхания. Они отщепляют водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы могут переносить водород непосредственно на молекулярный кислород, другие - только на какие-либо иные акцепторы, например 'метиленовую синь. Дегидрогеназы катализируют дегидрирование органических веществ и выполняют роль промежуточных переносчиков водорода. При этом субстратами дегидрирования могут быть различные углеводы, органические кислоты, аминокислоты, гуминовые кислоты и т. д. В почве активно действуют дегидрогеназы углеводов и органических кислот. Отщепляемый в процессе дегидрирования водород может передаваться кислороду воздуха (аэробные дегидрогеназы) или органическим веществам типа хинонов (анаэробные дегидрогеназы). Активность де гидрогеназ является показателем жизнедеятельности микроорганизмов
и количества гумусовых веществ, поддающихся разложению микробами.
При определении активности дегидрогеназ в качестве акцептора водорода применяют соль 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый (ТТХ). При этом бесцветные соли тетразолия восстанавливаются в красные соединения трифенилформазана (ТФФ).
Ход анализа
Навеску почвы помешают в вакуумную колбу объемом 50 см5 с притертой стеклянной пробкой. Добавляют 10 мг СаСОэ и тщательно смешивают. Добавляют 1 см5 0,1 М раствора глюкозы и I см3 1%-го раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого.
Определение проводится в анаэробных условиях. Для этого воздух из колбы удаляют при разрежении 10-12 мм ртутного столба в течение 2 -3 мин.
Колбу осторожно встряхивают и ставят в термостат при 37°С на 24 ч. После инкубирования добавляют 23 см’ этилового спирта-ректифи- ката и встряхивают 5 мин. Полученный раствор фильтруют и колори- мстрируют в кюветах шириной 5 мм, используя светофильтр с длиной волны 500- 600 нм.
Количество формазана в миллиграммах, соответствующее оптической плотности опытного раствора, рассчитывают по калибровочному графику.
Определение активности дегидрогеназы
Ход анализа
Навеску почвы 1 г помещают в пробирку, добавляют 10 мг CaCOj, тщательно смешивают с почвой встряхиванием. Добавляют 1 см’ 0,1 М раствора глюкозы и 1 см? 1%-го раствора 2,3,5-трифенилфосфата хлористого, перемешивают.
Определение проводят в анаэробных условиях. Подготовленные пробирки с образцами почвы помещают в анаэростат, закрывают его и соединяют с вакуумным насосом. Затем медленно удаляют воздух из анаэростата в течение 3-5 мин, достигая разрежения 0,9-1 атм. (что соответствует 10 мм ртутного столба). Анаэростат с находящимися в нем пробирками ставят в политермостат при температуре 37°С на 24 ч. После инкубирования медленно ослабляют винт крышки анаэростата для постепенного заполнения прибора атмосферным воздухом.
В пробирки с образцами добавляют по 23 см3 этилового спирта- ректификата, встряхивают 5 мин. Полученный раствор фильтруют в мерные колбы на 25 см3. Фильтрат в мерных колбах доводят до метки спиртом-ректификатом, перемешивают и сразу колориметрируют в кюветах на 5 мм, используя светофильтр с длиной волны 500 - 600 нм.
Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ:
CO(NHz)}-+ 2 NH> + СО у + И20
Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение. Она образуется и в самой почве в качестве продукта превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот.
Ход анализ
В колбу Эрленмейера на 50 см' берут 5 г почвы, добавляют 10 см3 фосфатного буфера (pH 6,7), 10 см3 10%-го раствора мочевины. Колбу закрывают ватной или корковой пробкой, встряхивают и ставят в термостат при температу ре 37°С на 24 ч.
После инкубации содержимое колбы фильтруют в мерную колбу (объем колбы выбирают в зависимости от содержания аммония). Сначала на фильтр переносят только жидкость, затем в колбу добавляют 15 см* 1М раствора КС1, 5 мин встряхивают на ротаторе для вытеснения из почвы поглощенного аммония и продолжают фильтрование, объем фильтрата доводят до метки.
Далее количественное определение аммония, образовавшегося под действием мочевины можно проводить несколькими методами.
Определение количества аммония по Кьельдапо (полумикрометодом) и колориметрическим методом.
При определении по Кьсльдалю аликвоту фильтрата (объем под бирают в зависимости от активности уреазы - 10-20 см3) переносят в колбу для отгона аммиака (по Кьельдалю).
Колориметрический метод учета аммония с реактивом Несслера.
Из мерной колбы отбирают пробу 1-5-10 см' фильтрата (в зависимости от содержания аммиака) в мерную колбу на 50 см3, добавляют примерно 30 см' дистиллированной воды, перемешивают. Добавляют 2 см 50%-го раствора калия-натрия виннокислого, перемешивают. Прибавляют 2 см’ реактива Несслера, перемешивают, доводят водой до метки, перемеши вают.
Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах шириной 10 - 20 мм с синим светофильтром (длина волны 400 нм).
Далее количественное определение аммония, образовавшегося под действием мочевины можно проводить несколькими методами.
Определение количества аммония по Кьельдапо (полумикрометодом) и колориметрическим методом.
При определении по Кьсльдалю аликвоту фильтрата (объем под бирают в зависимости от активности уреазы - 10-20 см3) переносят в колбу для отгона аммиака (по Кьельдалю).
Колориметрический метод учета аммония с реактивом Несслера.
Из мерной колбы отбирают пробу 1-5-10 см' фильтрата (в зависимости от содержания аммиака) в мерную колбу на 50 см3, добавляют примерно 30 см' дистиллированной воды, перемешивают. Добавляют 2 см 50%-го раствора калия-натрия виннокислого, перемешивают. Прибавляют 2 см’ реактива Несслера, перемешивают, доводят водой до метки, перемеши вают.
Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах шириной 10 - 20 мм с синим светофильтром (длина волны 400 нм).
Ставят в термостат на I ч при температуре 30°С. Приливают цилиндром 45 cmj дистиллированной воды и взбалтывают на ротаторе
мин. Фильтруют через беззольный фильтр в мерную колбу на 50 см3. 20 см3 фильтрата пипеткой переносят в пробирку, добавляют 2 см5 10%-го аммиака, перемешивают.
Окрашенный раствор колорнметрируют при зеленом светофильтре в кюветах шириной 5 мм. Количество фенолфталеина, соответствующее взятому объему фильтрата, находят по графику.
Примечание Если растворы бурые, добавляют в колбу 1 см1 насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов.
Активность фосфатазы (X) выражают в миллиграммах Р2О5
1лл I (а-б) -р -0,45 ■ 100
на 100 г почвы за 1 час X = — — ,
н
где а - количество фенолфталеина по графику опытного образца, мг;
- количество фенолфталеина по графику контрольного образца, мг; н - навеска почвы, г; 100 - пересчет на 100 г почвы; 0,45 - коэффициент перевода фенолфталеинфосфата натрия в Р205, так как в субстрате одна молекула фенолфталеина связана с двумя молекулами фосфорной кислоты.
Реактивы
1%-й раствор фенолфталеинфосфата натрия.
10%-й водный аммиак.
Этиловый спирт-ре»стификат.
Насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов.
Стандартный раствор фенолфталеина: 0,01 г фенолфталеина растворяют в 60 cmj этилового спирта и обьем доводят до 100 см*. 1 см5 этого раствора содержит 0.1 мг фенолфталеина. Далее отбирают аликвоты образцового раствора, соответствующие 0,02; 0,04; 0.06: 0.08: 0.1 мг Р;05 в 50 см\ окрашивают, как и испыту емые растворы, колориметрирчют и строят калибровочный i рафик.
Определение активности фосфатазы с использованием в качестве субстрата Р-глицерофосфата натрия
Ход анализа
Навеску почвы 1 г помешают в колбу Эрленмейера на 50 см3, приливают 0,9 см5 дистиллированной воды для увлажнения почвы до 90% (при определении активности щелочной и кислой фосфатаз вместо воды приливают такое же количество боратного буфера с pH соот ветственно 5,3 и 9,0). Затем прибавляют 1 см’ раствора, содержащего 5 мг Р-глицерофосфата натрия. Колбы закрывают пробками, взбалтывают 5 мин. на ротаторе и помещают в термостат при температуре 30°С на 1 час. После инкубации добавляют 45 cmj воды, взбалтывают 5 мин. и фильтруют через беззольный фильтр в мерные колбы на 50 - 100 см3.
Глюкозидгидролазы
Г.шкошдгидролазы - большая группа ферментов, катализирую щих гидролиз ди-, три- и полисахаридов по глюкозидным связям в их молекулах. Углеводы и близкие к ним вещества содержатся в почвенном органическом веществе, микроорганизмах и растениях в значительном количестве. В почве обнаружены моно-, ди- и полисахариды (целлюлоза, гемицеллюлозы, крахмал и др.), поступающие в почву главным образом в составе растительных остатков, которые могут содержать до 60% углеводов. В биохимическом превращении этих веществ участвует специфический фермент или группа ферментов.
fi-Фруктофуранозидаза (инвертаза)
(fi-Фру ктофураноэид-фруктогидролаза. КФ 3.2.1.26)
Р-Фруктофуранозидазу обнаруживают во всех почвах, она является одним из важных ферментов, характеризующих биологическую актив ность почвы.
З-Фруктофуранозидаза (сахараза, инвертаза) действует на глико- зильные соединения: гидролизует сахарозу, рафинозу, генцианозу и стахиозу; катализирует фруктотрансферазные реакции. При расщеплении сахарозы на глюкозу и фруктозу разрывается связь, находящаяся у (5- глюкозидного углеродного атома остатка фруктозы в молекуле сахарозы.
Метод основан на использовании редуцирующих свойств глюкозы и фруктозы, образующихся при гидролизе сахарозы, - способности восстанавливать окисную медь до закисной (метод Бертрана). Сумму редуцирующих гексоз выражают в глюкозном эквиваленте.
Количественное определение глюкозы и фруктозы образовавшихся после гидролиза сахарозы можно определять с пикриновой кислотой (см. раздел «Анализ растений»).
Ход анализа
Навеску почвы 5 г помещают в колбу Эрленмсйера на 50 см1. Добавляют пипеткой 10 см3 5%-го раствора сахарозы, приливают цилиндром 10 см3 ацетатного буфера (pH 4,7) и 0,5 см3 толуола. Закрывают колбу корковой пробкой, 3 мин взбалтывают на ротаторе и ставят в термостат при 37°С на 24 ч.
После инкубации реакционную смесь фильтруют в мерные колбы (емкость колбы зависит от количества продукта реакции - 100, 200 см3 и т.д.). Далее определение сахаров ведут по одному из методов, описанных в разделе «Анализ растений».
Определение сахаров по методу Бертрана
Пипеткой отбирают 10-20 см’ фильтрата (в зависимости от актив ности инвертазы) в колбу Эрленмейера на 100 см3, сразу же приливают раствор Феллинга (если аликвота из раствора сахаров 10 см3, добавляют 10 см3 4%-го раствора сернокислой меди и 10 см3 раствора сегнетовой соли; если аликвота 20 см3, берут по 20 см3 сернокислой меди и сегнетовой соли), перемешивают и ставят на горелку или электроплитку' и кипятят по песочным часам 3 мин.
С помощью водоструйного или масляного насоса фильтруют горячий раствор через трубку Аллина в колбу Бунзена.
Промывают колбу и трубку Аллина с осадком закисной меди от щелочи 7-8 раз горячей дистиллированной водой, не оставляя осадок закиси меди на воздухе. Трубку Аллина с промытым осадком переносят в малую колбу Бунзена, растворяют осадок 15-20 см3 раствора железо аммиачных квасцов, приливая их сначала в колбу Эрленмейера, а затем в трубку Аллина. Колбу и трубку несколько раз промывают небольшими порциями горячей воды.
Раствор в колбе Бунзена титруют из бюретки 0,1 М раствором перманганата калия до слабо-розовой окраски.
Для расчета содержания сахаров в объеме раствора, взятого для анализа, количество перманганата (с учетом поправки к титру) умножают на 6,36, так как 1 см3 0,1 М КМп04 эквивалентен 6,36 мг Си20. По весу закиси меди находят соответствующее количество глюкозы (см. таблицу 25 в ПРИЛОЖЕНИИ). Таким же способом определяют содержание глюкозы в контроле.
После внесения поправки на контроль рассчитывают активность инвертазы (X) в мг глюкозы на 100 г почвы за сутки:
уг _ а -р • 100 н
где а - количество глюкозы в объеме раствора, взятого для анализа за вычетом контролей (находят по таблице 25 в приложении), мг; р - раз- ведение; н - навеска почвы, г.