Лабор.работа. Изучение химических и биологических способов асептики, применяемых в биотехнологических процессах. Лабор.работа №3 Изучение химических и биологических способов асе. Лабораторная работа 3 Изучение химических и биологических способов антисептики, применяемых в биотехнологических процессах
 Скачать 83 Kb.
|
|
Лабораторная работа №3 Изучение химических и биологических способов антисептики, применяемых в биотехнологических процессах Асептика (от греческого a – не, нет, sepsis – гниение) – это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду (объект) посторонних микроорганизмов, включая болезнетворные (патогенные). Следовательно, асептика в биотехнологии и в медицине, например, в хирургической практике – это не одно и то же понятие. В биотехнологии предполагают использование какого-либо биообъекта (в том числе микробного) и полное исключение попадания других микроорганизмов, являющихся посторонними. В медицине стремятся исключить любую возможность попадания патогенных микробов и микробов-контаминантов (от латинского contamination – загрязнение) на операционное поле или рану. Каждый из материальных потоков в биотехнологических процессах – потенциальный источник микробов-контаминантов. Асептика может включать влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в специальных асептических помещениях (микробиологических боксах), поступление в ферментатор стерильного воздуха через барботёр (от фрацузского barbotage – перемешивание) и пр. Следовательно, комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов включает: механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости и конечный продукт. К механической защите относятся: удаление механических примесей (например, из воздуха) герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к физической – обработка воздуха и поверхностей приборов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической – обработка поверхностей химическими антисептиками. Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение и подавление роста микроорганизмов, находящихся в контакте с макроорганизмом (человеком) и технологическим оборудованием. Антисептическая обработка направлена на обеззараживание кожи и слизистых оболочек человека, поверхносте в производственных помещениях и технологического оборудования. Основные источники контаминации в биотехнологическом производстве Основными источниками попадания микроорганизмов в сферу производства являются персонал, сырье, вода, воздух, вспомогательные вещества, упаковочные материалы, производственные помещения, оборудование, питательная среда, посевной материал, пеногаситель. Персонал. Основные пути попадания микроорганизмов от персонала в сферу производства включают: – воздушно-капельный; – воздушно-пылевой и контактный. Выделяют следующие причины контаминации объектов производства от персонала: – человеческий организм – естественная среда обитания микроорганизмов; – технологические операции выполняются людьми, страдающими заболеваниями желудочно-кишечного тракта, кожи, дыхательных путей, а также имеющими повышенную потливость либо сухость кожных покровов; – отсутствие или неудовлетворительное состояние технологической одежды, ее неудовлетворительная подготовка; – несоблюдение персоналом требований к личной и производственной гигиены; – несоблюдение правил поведения в ходе технологического процесса; – неправильный подбор или обучение персонала, без учета характера человека и особенности работы его нервной системы. Для входа в чистые помещения разных классов чистоты используется технологическая одежда – комплект производственной одежды, специально предназначенной для защиты сырья, упаковочных материалов, продукции, производственной среды от контаминации микроорганизмами и механическими частицами, выделяемыми человеком, и для защиты человека от опасных и вредных производственных факторов. Ткань для изготовления технологической одежды должна обладать минимальным ворсоотделением, пылеемкостью, пылепроницаемостью, а также воздухопроницаемостью не ниже 300 м3/(м2∙с), гигроскопичностью не менее 7 %, не накапливать электростатического заряда. Для изготовления технологической одежды применяют ткани из полиэфирных, полипропиленовых или полиалкидных волокон, для изготовления нижней одежды используется ткань из лавсана с хлопком. Воздух. Воздух производственных помещений делят на: Атмосферный воздух поступает в непроизводственные помещения предприятия из окружающей среды без предварительной очистки. Вентиляционный воздух (прошедший через специальные системы воздухоподготовки атмосферный воздух) подается для вентиляции производственных помещений. Технологический воздух (очищенный от механических частиц и стерилизованный атмосферный воздух) используется в технологических процессах: для аэрирования при культивировании клеток-продуцентов, для передвижения технологических жидкостей и сыпучих материалов, для сухожаровой стерилизации материалов первичной упаковки. Основными причинами попадания микроорганизмов в объекты производства с воздухом являются первичное высокое загрязнение атмосферного воздуха и неэффективность систем воздухоподготовки. Оборудование. Микробная контаминация от оборудования возможна при неудовлетворительной подготовке оборудования к работе – некачественной мойке, дезинфекции, стерилизации, при нарушении правил эксплуатации, а также использовании некачественных материалов внутренней поверхности. Контаминация от оборудования для ферментации дополнительно к перечисленным причинам может случиться из-за: – разгерметизации ферментационного комплекса во время работы; – конструкционных особенностей оборудования и коммуникаций, не обеспечивающих стерилизуемость всех точек внутренних полостей. Вода. Вода в производстве используется как основное и как вспомогательное сырье. Меры по предупреждению контаминации воды микроорганизмами на стадии ее подготовки: – правильная организация системы водоподготовки; – выбор материалов трубопроводов; – соединение и расположение трубопроводов должно обеспечивать возможность стерилизации путем пропускания чистящих и стерилизующих растворов со скоростью не менее 1,5 м/с в трубах наибольшего диаметра. Химические средства антисептики Обработка химическими веществами, обладающими неспецифическим антимикробным действием, производится путем обмывания, протирания, погружения, заполнения или аэрозольной обработки (орошением, распылением, испарением). Для химической дезинфекции применяют окислители, поверхностно-активные вещества (ПАВ), спирты, альдегиды, надкислоты и фенолы. Объектами химической дезинфекции на производствах являются поверхности оборудования и стен, рабочие поверхности, инструменты. Промышленная антисептика – отдельная область промышленной дезинфекции, которая предусматривает использование химических веществ неспецифического антимикробного действия (антисептиков) для уничтожения или подавления размножения микроорганизмов на поверхности кожи (реже слизистых оболочках) персонала, занятого в производстве. Основные требования, предъявляемые к химическим дезинфектантам и антисептикам: – хорошая растворимость или способность смешиваться с водой с образованием стойких смесей; – низкая токсичность и отсутствие раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки; – широкий спектр антимикробной активности с ее проявлением в максимально короткое время; – способность хорошо смачивать объекты и не оказывать на них коррозирующего или другого разрушающего действия; – стабильность в процессе хранения; – наличие разрешения на использование вещества в качестве дезинфектанта в химико-фармацевтической промышленности В качестве средств для антисептики используют различные соединения, наиболее часто это галогенсодержащие соединения, соединения с активным кислородом, соединения алифатического ряда, поверхностно-активные вещества (ПАВ), окислители (Н2О2, КМnО4), красители (бриллиантовый зеленый, метиленовый синий), кислоты (бензойная, салициловая, борная), щелочи. Галогенсодержащие соединения представлены препаратами, содержащими хлор и йод. Механизм бактерицидного действия хлора связан с его взаимодействием с белками цитоплазмы микроорганизмов. В молекуле белка хлор замещает атом водорода, который связан с атомом азота, что приводит к нарушению образования водородных связей в результате чего нарушается вторичная структура белка. Кроме того, при взаимодействии хлора с водой освобождается атомарный кислород, который окисляет жизненно важные ферменты микроорганизмов. Соединения алифатического ряда (альдегиды и спирты) представлены этиловым спиртом и формальдегидом. Оба препарата вызывают денатурацию белка, дегидратацию клеток. Биологические средства антисептики Биологическая антисептика — применение биопрепаратов, действующих как непосредственно на микроорганизмы и их токсины, так и действующих через макроорганизм. К таким препаратам относятся: антибиотики и сульфаниламиды, оказывающие бактерицидное или бактериостатическое действие; ферментные препараты, бактериофаги — пожиратели бактерий; антитоксины — специфические антитела (средства для пассивной иммунизации), образующиеся в организме человека под действием сывороток, анатоксины (средства для активной иммунизации), иммуностимулирующие средства. Антитоксины являются одним из факторов иммунитета при столбняке, дифтерии, ботулизме, газовой гангрене и других заболеваниях. Антибиотики — это химические соединения биологического происхождения, оказывающие избирательное повреждающие или губительное действие на микроорганизмы. Антибиотики, применяемые в медицинской практике, продуцируются актиномицетами, плесневыми грибами, а также некоторыми бактериями. К этой группе препаратов также относятся синтетические аналоги и производные природных антибиотиков. По спектру антимикробного действия антибиотики отличаются довольно существенно, кроме того, воздействуя на микроорганизм, антибиотики вызывают либо бактериостатический, либо бактерицидный эффект. Механизм действия многих противомикробных средств не вполне выяснен. Тем не менее, можно утверждать, что действие большинства антибиотиков заключается в нарушении проницаемости клеточной мембраны и угнетении синтеза веществ, образующих клеточные мембраны бактерии или белка внутри микробной клетки (в том числе и путем угнетения синтеза РНК). Канамицин – антибиотик широкого спектра действия из группы аминогликозидов проникает в микробную клетку связывается со специфичными белками - рецепторами на 30S субъединице рибосом. Нарушает образование комплекса транспортной и матричной РНК (30S субъединицей рибосомы) и останавливает синтез протеинов повреждает мембраны микробной клетки. Цель и задачи работы: определить эффективность химических и биологических способов антисептики. Задачи работы: 1. Подвергнуть технологическое оборудование химической обработке. 2. Провести санитарно-микробиологический контроль обработанных участков технологического оборудования. 3. Суспензии микроорганизмов подвергнуть воздействию биологических средств антисептики разной продолжительности. 4. Провести контрольные посевы суспензий для каждой продолжительности воздействия биологических средств антисептики. 5. По полученным результатам сделать развернутое заключение о характере влияния химических и биологических способов антисептики на клетки микроорганизмов, условиях эффективного воздействия этих способов и их использовании в биотехнологических производствах. Материалы и оборудование: спиртовки, термостат, стерильные тампоны, пинцеты, колбы со стерильной водой, чашки Петри, пипетки, питательные среды МПА, LB, растворы 96% этанола, 1% формалина, 0.1% CaCl2, суспензии бактерий Bacillussubtillis, Escherichiacoli, раствор канамицина 200 мкг/мл. Ход работы Изучение химических способов антисептики 1. Поверхность технологического оборудования разбивают на 4 квадрата площадью 100 см2, один квадрат оставляют необработанным, три других обрабатывают растворами 96% этанола, 1% формалина, 0.1% CaCl2. 2. Делают смывы с каждого квадрата. Перед взятием смыва тампон погружают в стерильную воду. Смоченным тампоном обтирают поверхность площадью 100 см2 во взаимоперпендикулярных направлениях. После этого тампон погружают в пробирку, встряхивают и дают отстояться 2-3 мин. 3. Для определения ОМЧ 1 см3 смывной жидкости переносят в чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным питательным агаром (метод глубинного посева). Инкубируют посев при (30±1)0С, 72 ч. Результат выражают в колониеобразующих единицах - КОЕ/см3 или КОЕ/см2, а также в % от контроля. КОЕ/см3=(Х*P)/V (1) где X – среднее число колоний на чашках Р – разведение V – объем высеваемой суспензии КОЕ/см2=(Х*P)/S (2) где X – среднее число колоний на чашках Р – разведение S – площадь квадрата, с которого делали смыв Изучение биологических способов антисептики 1. Предварительно перемешав исходную суспензию микроорганизмов (Bacillussubtillis или Escherichia coli), отбирают 4 см3 и помещают в пробирку с 4 см3 раствора канамицина концентрацией 200 мкг/мл. Параллельно делают контроль, отбирая 4 см3 суспензии и помещая в пробирку с 4 см3 стерильной воды. 2. Через определенные промежутки времени (15 минут) отбирают из пробирок пробы микробных суспензий для подсчета числа КОЕ. 1 см3 суспензии переносят в чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным питательным агаром (Bacillussubtillis) или LB (Escherichia coli). Инкубируют посев при (30±1)0С (Bacillus subtillis) или (37±1)0С (Escherichia coli), 72 ч. Контрольные пробы высевают единожды, отбирая вместе с последней опытной пробой. Результат выражают в колониеобразующих единицах - КОЕ/см3 или КОЕ/см2, а также в % от контроля. Оформление результатов Эффективность химических способов асептики, КОЕ/см2
Эффективность биологических способов асептики, КОЕ/см2
По полученным результатам сделайте развернутое заключение о характере влияния химических и биологических способов антисептики на клетки микроорганизмов, условиях эффективного воздействия этих способов и их использовании в биотехнологических производствах. Контрольные вопросы 1. Что понимают под асептикой и антисептикой? 2. Источники контаминации в биотехнологическом производстве? 3. Приведите примеры химических и биологических средств антисептики? 4. Каковы причины гибели клеток микроорганизмов при воздействии различных химических соединений? | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||