Оло. ЛР-4 Гидролиз крахмала. Лабораторная работа 4 Гидролиз крахмала
 Скачать 50.45 Kb.
|
|
Лабораторная работа №4 Гидролиз крахмала Крахмал представляет собой полисахарид. Его молекула состоит из открытых неразветвленных цепей — амилозы (ее в крахмале содержится до 30%), а также из открытоцепных разветвленных молекул, имеющих боковые цепи — амилопектина (его содержание в крахмале до 70%). Ниже приведена формула амилозы (в общем виде):  Молекулы крахмала глобулярны, т.е. свернуты в клубок. Относительная молекулярная масса достигает 100 000 (амилоза) и до 1 000 000 (амилопектин). Крахмал — твердое, белое, кристаллическое или аморфное вещество, нерастворимое в воде, но способное образовывать в ней коллоидные растворы (крахмальный клейстер). Это связано с тем, что молекулы воды проникают внутрь глобулярных молекул крахмала, увеличивают их в объеме и эти молекулы способны переходить во взвешенное состояние. Кроме этого, между молекулами воды и гидроксильными группами, входящими в состав молекул крахмала, образуются водородные связи, которые также способствуют образованию коллоидных систем. Крахмал способен к гидролизу, конечным продуктом которого является α-глюкоза. Процесс гидролиза крахмала реализуется либо химическим путём при повышенных температурах в присутствии катализатора (разбавленной серной, соляной кислоты), либо в организмах — при температуре тела в присутствии различных ферментов (птиалина, амилазы, мальтазы и др.). Цель работы: провести ферментативный и кислотный гидролиз крахмала и определить факторы, влияющие на скорость гидролиза. Ферментативный гидролиз крахмала α-амилазой слюны Фермент α-амилаза (диастаза) содержится в слюне и ускоряет гидролитическое расщепление α -1,4-гликозидных связей в молекулах полисахаридов (крахмала, гликогена) до декстринов и мальтозы. Процесс распада полисахаридов в присутствии α-амилазы включает в себя ряд стадий: крахмал, амилодекстрины, эритродекстрин, ахродекстрины, альтотетроза, мальтоза. При этом нерасщепленный крахмал при взаимодействии с раствором йода дает синее окрашивание, амилодекстрины – фиолетовое, эритродекстрины – красно-бурое, ахродекстрины, альтотетроза и мальтоза – желтое. Кроме того, конечный продукт гидролиза крахмала – мальтоза – имеет свободную альдегидную группу, которую можно обнаружить реакцией Троммера (Фелинга). Реактив Фелинга состоит из равных объёмов раствора сложной соли тартрата натрия-калия и раствора сульфата меди. Приготавливается непосредственно перед анализом путём смешения двух растворов. Также можно проводить пробу Троммера, в которой используют свежеприготовленный раствор сульфата меди (II) с гидроксидом натрия. В основе пробы Троммера (Фелинга) лежит окислительно-восстановительная реакция восстановления гидрата окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (красного цвета) при нагревании. Таким образом, по окраске раствора, содержащего слюну и крахмал, с йодом или проведением реакции Троммера можно выявить степень активности α-амилазы. Одним из характерных свойств ферментов, является термолабильность, т.е. чувствительность к температуре, при которой протекает реакция. Для многих энзимов максимальная скорость реакции наблюдается при 38-40 оС. При нагревании выше 50 оС они утрачивают свойства биологических катализаторов вследствие денатурации, при этом степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа мала. При повышении температуры от 0 оС до 40 оС скорость реакции увеличивается, а затем тепловая денатурация фермента снижает ее. Оборудование и материалы: крахмал, вода, реактив Люголя (раствора йода в KI), реактив Фелинга или Троммера, электроплитка, колбы, мерный цилиндр, стакан химический, штатив с пробирками, пипетки. Ход работы: Слюну разводят в мерном цилиндре в 10 раз. В чистую пробирку отливают небольшое количество (2-3 мл) разведенной слюны и кипятят ее в течение 5-8 минут, а затем охлаждают. В 4 пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В первые две пробирки добавляют по 10 капель разведенной слюны. В третью – 10 капель прокипяченной слюны. В четвертую – 10 капель воды (в качестве контроля). Первую пробирку помещают в холодильник или ледяную баню, а остальные – в термостат или водяную баню при температуре 38 оС на 10 минут. После этого содержимое пробирок делят на 2 части и проводят качественные реакции на крахмал и продукты его расщепления (йодную пробу и пробу Троммера). Йодная проба. К 2 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора Люголя (раствора йода в KI). Первая проба приобретает фиолетовое окрашивание, третья и четвертая окрашиваются в синий цвет вследствие отсутствия или инактивации α-амилазы, вторая проба приобретает буро-желтую окраску в связи с расщеплением крахмала активной α-амилазой до декстринов. Реакция Троммера. К 5 каплям исследуемой жидкости добавляют 5 капель 10% раствора едкого натра и 5 капель 1% раствора сернокислой меди. Содержимое пробирки нагревают над пламенем горелки. Появление красного цвета указывает на присутствие в растворе мальтозы и глюкозы (положительная реакция Троммера). Результаты исследования записывают в таблицу 1: Таблица 1
Кислотный гидролиз крахмала Крахмал нерастворим в холодной воде, а в горячей образует коллоидный раствор — крахмальный клейстер. При кипячении крахмального клейстера с минеральной кислотой крахмал гидролизуется до глюкозы через ряд промежуточных продуктов с постепенно уменьшающейся молекулярной массой, называемых декстринами. Проследить за процессом гидролиза крахмала можно с помощью реакции с раствором йода, который окрашивает крахмал в синий цвет, амилодекстран — в фиолетовый, эритродекстран — в оранжевый, а с мальтодекстрином и мальтозой окрашивания уже не дает (остается желтым). Оборудование и материалы: крахмал, 20%-й раствор НСl, раствор Люголя, Na2CО3, Феллингова жидкость, электроплитка, колбы, мерный цилиндр, стакан химический, штатив с пробирками, пипетки. Ход работы: Приготовить 0,1 %-й крахмальный клейстер. Для этого отвесить 100 мг крахмала, высыпать крахмал в стаканчик, добавить 10 мл воды и тщательно размешать стеклянной палочкой. Налить в колбу 90 мл воды, нагреть до кипения, вылить в нее содержимое стаканчика, взболтать, дать раствору еще раз закипеть и снять с огня. Поставить в штатив шесть-семь пробирок. Отлить в первую пробирку 3 мл крахмального клейстера. Добавить в колбу с крахмальным клейстером 5 мл 20 %-го раствора НСl и нагревать на электроплитке. При появлении первых пузырьков (начало кипения) отлить из колбы 3 мл во вторую пробирку. Продолжать кипятить содержимое колбы, отливая из нее через каждые 5 мин по 3 мл в следующие пробирки. Дать пробам в пробирках остыть, разбавить их водой и добавить по пять капель раствора Люголя. Если окрашивание проб йодом отсутствует, гидролиз можно считать оконченным. Проделать с раствором, оставшимся в колбе, реакцию на редуцирующие сахара: налить 2—3 мл жидкости в чистую пробирку, нейтрализовать кислоту содой, прилить равный объем Феллинговой жидкости и довести до кипения. Результаты эксперимента записать в таблицу. Сделать вывод о причинах изменения окраски растворов, указать время, в течение которого произошел полный гидролиз крахмала. Отчёт о работе должен содержать: Цель работы Ход работы Результаты работы, представленные в виде таблицы. Уравнения реакций Выводы Ответы на контрольные вопросы Контрольные вопросы: Перечислите источники крахмала. К какому классу ферментов относится амилаза? Каков механизм ее действия? В каких источниках содержится амилаза? Как определяют количество амилазы в исследуемом образце? Как можно влиять на время ферментативного гидролиза крахмала? Как изменяется окраска реакционной смеси при добавлении раствора йода в течение реакции гидролиза крахмала? Составьте уравнение этой реакции. Каковы достоинства и недостатки ферментативного гидролиза в сравнении с химическим? | |||||||||||||||||||