Методические указания по молекулярной генетике указания обобщают современные данные в области молекулярной генетики, включая достижения науки последних лет, которые закладывают фундамент знаний, необходимых для дальнейшего обучения
 Скачать 273.42 Kb.
|
|
1 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКЕ Указания обобщают современные данные в области молекулярной генетики, включая достижения науки последних лет, которые закладывают фундамент знаний, необходимых для дальнейшего обучения. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ Функция ДНК как наследственного материала. Запись и хранение наследственного материала. Биологический код и его характеристика. Разнообразие белковых молекул определяется набором и порядком расположения аминокислот в полипептидных целях. Именно эта последовательность аминокислот в пептидных целях, определяя свойства белка, зашифрована в молекуле ДНК с помощью биологического кода. Уникальность молекул ДНК достигается различной последовательностью четырех нуклеотидов на нити ДНК. Как было установлено в эксперименте, кодирование отдельной аминокислоты осуществляется с помощью трех рядом стоящих нуклеотидов (триплетов) в полинуклеотидной цепи ДНК. Число возможных триплетов, которые образуются четырьмя нуклеотидами, соответствует 4 3 = 64. Такого количества триплетов вполне достаточно, чтобы зашифровать 20 наиболее распространенных в природе аминокислот, входящих в состав белка. В работах Ниренберга и Очао (1961 -1964 гг.), посвященных расшифровке биологического кода, было установлено, что из 64 триплетов 61 кодирует аминокислоты, три триплета, не кодирующие никаких аминокислот, были названы НОНСЕНС - триплетами: UАА, UАG, UGА. Избыток кодирующих триплетов объясняется тем, что большинство аминокислот шифруется более чем одним (от 2 до 6) триплетом. Таким образом, расшифровка биологического кода показала, что он: 1. триплетен (одна аминокислота кодируется тремя рядом стоящими нуклеотидами); 2. специфичен (один и тот даже триплет кодирует только одну определенную аминокислоту). 3. универсален (он применим для всех живых организмов); 4. вырожден (то есть одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими различными триплетами); 2 5. однонаправлен (считывание информации происходит только в одном направлении); 6. не перекрываем (то есть каждый нуклеотид входит в состав только одного триплета и занимает в нем строго определенное место). Неперекрываемость кода была доказана экспериментально. У человека известно несколько форм гемоглобина, отличающихся только одной аминокислотой. Они возникли путем изменения только одного нуклеотида, кислота входит в состав нормального гемоглобина А, валин - в состав патологического гемоглобина S. В условиях гипоксемии такие эритроциты приобретают серповидную форму. Редупликация (репликация) наследственного материала. Одним из свойств наследственного материала является способность ДНК к самовоспроизведению (самоудвоению, авторепродукции). Для репликации ДНК требуется участие множества белков, которые быстро движутся вдоль ДНК и согласованно осуществляют процесс репликации с высокой точностью. Репликация включает несколько этапов: 1. Разрыв водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями двух полинуклеотидных цепей осуществляет фермент ДНК-геликаза, расплетая двойную спираль ДНК. 2. ДНК-топоизомераза разрывает фосфодиэфирную связь в одной из полинуклеотидных цепей ДНК, снимая напряжение, вызываемое расплетением спирали и расхождение цепей в репликационной вилке. 3. Дестабилизирующие белки выпрямляют участок ДНК, растягивают одиночные цепи ДНК, не позволяя им сомкнуться, и делают азотистые основания свободными для связывания с комплементарными нуклеотидами. 4. В области репликацинной вилки действуют ферменты ДНК-полимеразы: на ведущей (лидирующей) и отстающей (запаздывающей) цепях. На ведущей цепи ДНК-полимераза работает непрерывно, а на отстающей фермент время от времени прерывает и вновь возобновляет свою работу, используя короткие молекулы РНК-затравки, синтезируемые ферментом ДНК-праймазой. 5. ДНК-праймаза синтезирует одну РНК-затравку ("праймер") для лидирующей цепи и для каждого фрагмента ДНК (фрагмента Оказаки) в запаздывающей, У прокариот фрагменты Оказаки содержат от 1000-2000 нуклеотидов. У эукариот значительно короче- 100-200 нуклеотидов. Молекула ДНК-праймазы непосредственно связана с ДНК-геликазой, образуя структуру, называемую ПРАИМОСОМОЙ, которая движется в направлении 3 раскрывания репликационной вилки и по ходу движения синтезирует РНК-затравку для фрагментов Оказаки. В этом же направлении движется ДНК -полимераза ведущей цепи и ДНК-полимераза отстающей цепи. Для этого, как полагают, последняя накладывает цепь ДНК, которая служит ей матрицей, саму на себя, что и обеспечивает разворот ДНК- полимеразы отстающей цепи на 180°. Согласованное движение двух ДНК-полимераз обеспечивает координированную репликацию обеих нитей. Репликация происходит путем непрерывного роста обеих новых цепей по мере перемещения репликационной вилки, при этом, так как две цепи в спирали ДНК антипараллельны, одна из дочерних цепей должна была бы расти в направлении 5'→ 3' концу, а другая - от 3' → 5'. В действительности, оказалось, что дочерние цепи растут только в направлении 5' →3', то есть всегда удлиняется 3' - конец затравки, а матрица считывается ДНК -полимеразой в направлении 3'→ 5'. 6. РНК-затравка, не обладающая корректирующей активностью, отличается от новосинтезированной цепи ДНК, поскольку состоит из рибонуклеотидов и в дальнейшем удаляется с помощью специфической рибонуклеазы. Образовавшиеся бреши достраиваются комплементарными участками ДНК. 7. Соединение синтезированных фрагментов ДНК (фрагментов Оказаки) происходит с помощью фермента ДНК-лигазы в запаздывающей нити ДНК. В процессе репликации синтез новых полинуклеотидных цепей осуществляется в соответствии с принципами комплементарности и антипараллельности. На каждой их двух ранее существовавших материнских полинуклеотидных цепей синтезируется комплементарная ей полинуклеотидная цепь. В результате репликации в дочерних молекулах ДНК одна полинуклеотидная цепь является вновь синтезированной, а другая - ранее входила в состав материнской молекулы ДНК. Такой способ синтеза называется полу консервативным. Благодаря ему обеспечивается точное воспроизведение в дочерних молекулах ДНК той информации, которая была записана в материнской молекуле. Репликация осуществляется в синтетический период жизненного цикла клетки перед митозом и мейозом. "Проблема концевой репликации" заключается в том. что все известные ДНК-полимеразы, являющиеся ключевыми ферментами сложного репликативного белкового комплекса, неспособны полностью реплицировать концы линейных молекул ДН К. Для того чтобы клетки не теряли при делении часть генетического материала, 3'-концы ДНК хромосом эукариот наращиваются перед каждым раундом репликации короткими повторяющимися последовательностями. Это осуществляется ферментами — теломеразами. 4 Генетический материал живых организмов имеет огромные размеры и реплицируется с высокой точностью. В среднем в процессе воспроизведения генома млекопитающего, состоящего из ДНК длиной 3 млрд. пар нуклеотидов, возникает не более трех ошибок. При этом ДНК синтезируется очень быстро (скорость ее полимеризации колеблется в пределах от 500 нуклеотидов /с. у бактерий до 50 нуклеотидов/ с. у млекопитающих). Высокая точность репликации, наряду с ее высокой скоростью, обеспечивается наличием специальных механизмов, осуществляющих коррекцию, т.е. устраняющих ошибки. Суть механизма коррекции заключается в том, что ДНК-полимеразы дважды проверяют соответствие каждого нуклеотида матрице: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь синтезируется лишь в том случае, если последний (3'- концевой) нуклеотид растущей цепи ДНК образовал правильную уотсон-криковскую пару с соответствующим нуклеотидом матрицы. Если же на предыдущей стадии реакции произошло ошибочное спаривание оснований, то дальнейшая полимеризация останавливается до тех пор, пока ошибка не будет исправлена. Для этого фермент перемещается в обратном направлении и вырезает последнее добавленное звено, после чего его место может занять правильный нуклеотид - предшественник. Репаративный синтез ДНК. В процессе жизнедеятельности под действием различных факторов в ДНК возникают повреждения, некоторые из них могут ликвидироваться благодаря репарации ДНК. Механизм репарации ДНК изучен на кишечной палочке. При воздействии на культуру кишечной палочки ультрафиолетовыми лучами на нити ДНК возникают повреждения - димеры (цитозин-цитозин, цитозин-тимин, чаще всего возникают димеры тимина, соединенные через атомы углерода и представляющие собой наиболее стойкие соединения). Димеры тимина приводят культуру кишечной палочки к гибели, если ее поместить в темноту. На свету димеры тимина расщепляются под действием фермента на два тнмина, тем самым восстанавливая структуру ДНК, это явление называется световая фотореактивация. Исправляются повреждения, возникшие под действием ультрафиолетовых лучей. Повреждения, возникшие под влиянием других факторов (ионизирующая радиация, химические вещества и др.) исправляется в результате темновой фазы репарации. Она осуществляется в 5 этапов: 5 1. Фермент эндонуклеаза надрезает цепочку ДНК в месте возникновения повреждения. 2. Фермент нуклеаза вырезает поврежденный участок. 3. Фермент экзонуклеаза расширяет брешь. 4. ДНК-полимераза латает брешь, синтезируя участок ДНК комплементарно неповрежденной цепочке. 5. Ферменты лигазы сшивают вновь построенный участок со старым, и целостность ДНК восстанавливается. Темновая репарация происходит во всех клетках на всех фазах жизненного цикла. У бактерий восстанавливается до 95% повреждений. Темновая репарация обнаружена у высших организмов в культуре тканей. У человека известны заболевания, связанные с возникновением мутаций к генах, детерминирующих ферменты темновой репарации. В настоящее время известно около 10 наследственных заболеваний с нарушением репарационных процессов в ДНК. Пигментная ксеродерма - группа заболеваний, при которых отмечается повышенная чувствительность кожи к солнечным лучам (покраснение, пигментация, изъязвления, злокачественные образования). Это рецессивно-аутосомное заболевание. Фибробласты кожи больных людей более чувствительны к ультрафиолетовым лучам, чем фибробласты здоровых людей. Это связано с тем, что они обладают пониженной способностью выщеплять димеры тимина, следовательно, имеет место нарушение репарации на первом ее этапе, то есть произошла мутация в гене, кодирующем синтез ультрафиолетовой специфической эндонуклеазы. Возможны нарушения и на других этапах репарации ДНК или даже на нескольких этапах. Атаксия - телеангноэктазия (синдром Луи Бара) - прогрессирующая атаксия мозжечка с нарушением координации движений, телеангиоэктазия склер. В этом случае сильно запаздывает второй этап репарации - удаление поврежденных оснований молекулы ДНК. Панцитопения при гипо- и апластических анемиях. Поражены все ростки костного мозга. При этом заболевании нарушен третий этап темновой репарации -синтез экзонуклеазы, завершающей вырезание поврежденного участка ДНК. Синдром Блума - сочетание недоразвития скелета, гипофизарной карликовости, гипогонадизма с врожденной телеангиоэктатической эритермой лица, участками гиперкератоза и гиперпигментации на туловище. Эти аномалии связаны с нарушением пострепликативного восстановления - 4, 5 этапов репарации. На нити ДНК в структуре гена могут возникнуть и нерепарируемые изменения - генные или точковые мутации: 1. Миссенс-мутация. Связаны с заменой одного нуклеотида на другой. В результате такой 6 мутации возникло заболевание серповидноклеточная анемия. У гомозиготных носителей этого гена в эритроцитах содержится гемоглобин S, отличающийся от нормального гемоглобина. А только одной аминокислотой, потерявшей способность легко связывается с кислородом. 2. Нонсенс-мутация. Связана с образованием бессмысленных кодонов (УАА, УАГ, УГА). 3. Мутация со "сдвигом рамки". Наблюдаются при вставке или выпадении одного нуклеотида. Выявлены механизмы, снижающие частоту фенотипического проявления мутаций и биологические антимутагенные факторы: 1. триплетность и вырожденность генетического кода; 2. диплоидность (гетерозиготность) генотипа. Мутации чаще всего рецессивные и проявляются только в гомозиготном состоянии; 3. повторы генов на нити ДНК; 4. репаративные процессы; 5. метилирование ДНК (присоединение метильной группы СНз под действием фермента метилазы) предохраняет ДНК от действия рестриктаз (ферментов, расщепляющих ДНК). С возрастом процесс метилирования усиливается. Обеспечение реализации наследственной информации. Роль РНК. Наследственная информация, записанная с помощью генетического кода, хранится в молекуле ДНК. Процессы жизнедеятельности осуществляются в клетке на основе полученной информации, однако в этих процессах принимает участие не сама ДНК, а РНК, выполняющая роль посредника. Рибонуклеиновые кислоты (РНК), присутствующие в клетках как прокариот, так и эукарист, бывают трех основных типов: информационная (матричная - мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомная (рРНК). В ядре клеток эукарнот содержится РНК четвертого типа - гетерогенная ядерная РНК (гяРНК). В отличие от молекулы ДНК, РНК представляет собой одну полинуклеотидную цепь, включающую 4 разновидности нуклеотидов, содержащих остаток фосфорной кислоты, сахар-рибозу и одно из четырех азотистых оснований - аденин, гуанин, цитозин и урацил. Рибосомальная РНК (рРНК) входит в комплексе с белками в состав рибосом, функции которых непосредственно связаны с реализацией генетической информации при синтезе пептидных связей. Р-РНК образуется на матрице ДНК, в особых локусах - генах, отвечающих за ее синтез. 7 Т-РНК - короткая (70-80 нуклеотидов) полинуклеотидная цепь, осуществляющая функцию транспорта аминокислот к месту сборки пептидной цепи - к рибосоме. Эти молекулы также синтезируются на матрице ДНК. Особенностью тРНК является пространственная конфигурация. Благодаря образованию водородных связей между комплементарными последовательностями нуклеотидов молекула образует три петли. Средняя петля несет три нуклеотида (антикодон) комплементарных определенному кодону в молекуле иРНК, шифрующему данную аминокислоту. Так как один из нуклеотидов антикодона содержит нетипичное основание, которое может комплементировать с любым основанием кодона, то одна и та же тРНК способна узнавать несколько кодонов, различающихся по одну (главным образом третьему) основанию. В связи с этим в цитоплазме встречается около 40 видов различных тРНК, способных переносить 20 аминокислот. К 3' концу молекулы тРНК прикрепляется определенная молекула аминокислоты. Все тРНК начинаются с фосфорилированного 5' -конца; первым основанием обычно является G. На 3' -конце всегда присутствуют три основания -ЦЦА и концевая гидроксилъная группа (-ОН) - акцепторный конец. К этому концу присоединяется остаток аминокислоты. Прежде чем соединиться с тРНК, аминокислоты активируются. Активация аминокислот происходит при их взаимодействии с АТФ и образованием аминоациладенилата (активированная форма аминокислоты), который представляет собой смешанный ангидрид, образованный остатком фосфорной кислоты, АМФ и карбоксильной группой аминокислоты. С аминоациладенилата остаток аминокислоты переносится на тРНК, специфичную для каждой аминокислоты, и в виде аминоацил -тРНК поступает в рибосомы. Эти реакции катализируются ферментом аминоацил-тРНК-синтетазой, строго специфичным для каждой аминокислоты и каждой тРНК. и-РНК- молекула, на которую переписывается по принципу комплементарности информация с определенного участка молекулы ДНК. Списанная информация поступает в виде иРНК в цитоплазму и является инструкцией для сборки пептидной цепи на рибосоме. Таким образом, молекула ДНК при участии различных видов РНК обеспечивает специфический синтез в клетке. Реализация наследственной информации. Реализация у прокариот. В связи с тем, что у прокариот геном организован в виде кольцевидной молекулы ДНК, 8 расположенной непосредственно в цитоплазме клетки, различные этапы реализации наследственной информации практически не разобщены ни во времени, ни в пространстве. Транскрипция и сборка пептидной цепи - трансляция протекают практически одновременно. По мере освобождения начала молекулы иРНК от матрицы ДНК к ней присоединяются рибосомы и начинается синтез пептидных цепей. Особенности реализации наследственной информации у эукариот. Геном эукариот организован сложнее, чем у прокариот. Для него характерен хромосомный уровень организации. В хромосомах ДНК находится в окружении белков. В геноме эукариот имеется много избыточной ДНК. В конце 70-х годов было высказано предположение о наличии в генетическом материале эукариот неинформативных участков - интронов, которые вставлены между информативными - экзонами. Интронноэкзонная организация генов у эукариот определяет необходимость преобразования первичного транскрипта (преинформационной РНК - продукта транскрипции) в зрелую иРНК. Она должна быть освобождена от неинформативных участков и защищена против разрушающего воздействия ферментов цитоплазмы. Кроме того, у эукариот появляется ядерная мембрана, которая пространственно разобщает место хранения генетической информации (хромосомы в ядре) и место синтеза пептидной цепи (рибосомы). Иными словами, у эукарнот процессы транскрипции и трансляции разобщены как пространство (ядерной оболочкой), так и во времени (процессами созревания иРНК). Таким образом, в ходе реализации наследственной информации у эукариот выделяют следующие этапы: 1. Транскрипция; 2. Посттранскрипционные процессы (процессинг); 3. Трансляция; 4. Посттрансляционные процессы 1. Транскрипция - осуществляется с помощью РНК-полимераз. РНК-полимераза 1 синтезирует пре-рРНК. РНК-полимераза П синтезирует пре-иРНК. РНК-полимераза III - пре-тРНК. Раньше считали, что транскрипция происходит по 1 из 2-х расплетаемых нитей ДНК. Сейчас установлено, что транскрипция идет по обеим нитям в 2-х направлениях. Одна нить ДНК несет наследственную информацию (смысловая), другая, комплементарная ей - антисмысловая. В клетке антисмысловая иРНК играет роль в 9 управлении дифференцировкой и иногда - в регуляции синтеза белка. Если образуется комплекс (дуплекс иРНК + антисмысловая иРНК), тогда невозможен перенос иРНК из ядра в цитоплазму, следовательно, нет трансляции на рибосомах. В участке ДНК, соответствующем отдельному гену перед структурной частью, в которой зашифрована последовательность аминокислот в пептиде, обязательно располагается последовательность нуклеотидов, узнаваемая РНК-полимеразой. Такая последовательность называется промотором. РНК-полимераза находит промотор, взаимодействует с ним и после этого, двигаясь вдоль молекулы ДНК, обеспечивает постепенную сборку молекулы иРНК в соответствии с принципом комплементарности и антипараллельности. В конце структурной части гена расположен участок с особой последовательностью нуклеотидов - терминатор. Он обязательно включает один из нонсенс-триплетов, не кодирующих аминокислоты. В результате транскрипции синтезируется молекула преинформационной РНК. 2. |