Болезнь Помпе. Халибеков. Микробные биопленки
 Скачать 65.13 Kb.
|
1 2 МИКРОБНЫЕ БИОПЛЕНКИ Вплоть до конца прошлого века, то есть более 150 лет, микробиология развивалась главным образом на основе исследований чистых культур микроорганизмов. Более того, восприятие бактерий как одноклеточных форм жизни глубоко укоренилось именно благодаря исследованиям на чистых культурах. Поскольку бактерии могут быть рассеяны до одиночной колонии, являющейся потомством единственной клетки, и затем изучены в жидкой культуре, этот метод использовался в ходе большинства микробиологических исследований. Этот традиционный путь культивирования бактерий в жидкой среде способствовал изучению бактерий и прояснил многие аспекты физиологии микроорганизмов, однако рост чистой культуры во взвешенном состоянии встречается в природе крайне редко. В настоящее время основной частью микробиологов признано, что большинство микроорганизмов в естественных и искусственно созданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ - биопленок |1]. Эти естественные сообщества бактерий, окруженные матриксом, функционируют как скоординированный консорциум [2]. Несмотря на многочисленные наблюдения роста бактерий в виде биопленок, общая теория преобладания биопленок микроорганизмов над их свободноживущими формами была постулирована лишь в 1978 г [3]. Согласно этой теории, бактерии основную часть времени развития и размножения находятся в матриксе биопленки, прикрепленной к поверхностям богатых питательными веществами экосистем, и эти прикрепленные клетки физиологически отличны от клеток того же штамма, взвешенных в среде [2]. В принципе, планктонную стадию можно рассматривать лишь как способ перемещения микробной клетки от одной поверхности к другой, то есть кратковременное состояние в жизни бактерий. В настоящее время считается общепринятым представление о том, что биопленки развиваются на любом материале, который контактирует с любой жидкостью, где в принципе могут существовать микроорганизмы. Фактически любая поверхность, как биогенного, так и абиогенного происхождения, колонизирована микроорганизмами, и, следовательно, на несх этих поверхностях закономерно формируются биопленки. Более того, ни для одного вида бактерий не описано существование только в планктонном состоянии при всех возможных условиях роста [4, 5].  Наиболее уместное на данный момент определение биопленки состоит в следующем: Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, и демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов [6] Это определение позволяет отличить микробные сообщества биопленок от похожих на них лишь внешне структур, например, колонии бактерий, растущих на поверхности агара, которые не проявляют ни одной из характеристик, свойственных истинной биопленке. Важно отметить, что бактерии, включенные в матрикс фрагментов, которые отрываются от биопленок на колонизированном медицинском устройстве и циркулируют в жидкостях тела, устойчиво проявляют все фенотипические характеристики исходной биопленки. Показано, что микробные биопленки ответственны за этиологию и патогенез многих острых и, особенно, хронических бактериальных инфекций у человека. В природных экосистемах биопленка - почти неизменно многовидовое микробное сообщество, где каждый микроорганизм находится в собственной микронише в едином матриксе биопленки. Несмотря на то, что многовидовые биопленки более распространены в природе, одновидовые биопленки представляют специфический интерес для медицинских микробиологов ввиду их клинической важности. Как правило, одновидовые биопленки развиваются на медицинских имплантатах и вносят свой вклад в разнообразие инфекций, вызываемых персистирующими бактериями [7]. Инфекционные заболевания, этиологическими агентами которых являются биопленки, могут быть вызваны как представителями одного вида, так и сообществом видов бактерий. К ним относят пародонтит, кариес, воспаление среднего уха, муковисцидоз, бактериальный простатит и инфекционный эндокардит [8]. Кроме тканей организма хозяина, микробные биопленки колонизируют различные медицинские устройства небиологической природы, внедряемые в организм человека (катетеры, водители ритма, механические протезные сердечные клапаны, ортопедические устройства). Исследования имплантированных медицинских устройств с применением электронной микроскопии показали присутствие бактериальных биоплепок на этих абиогенных поверхностях [9, 10]. В целом, по некоторым данным, свыше 60 % всех впутрибольпичных инфекций происходит в результате деятельности микроорганизмов, находящихся в биопленках [1]. Хронические инфекции имплантированных медицинских устройств могут вести к развитию сепсиса и смерти пациенток, особенно у лиц с ослабленным иммунитетом, поэтому развитие микробных биопленок на синтетических имплантатах является большой проблемой для их успешного внедрения и эффективного функционирования [7]. В природных и искусственных экосистемах микроорганизмы формируют биопленки, в которых они защищены от антибактериальных нсществ, бактериофагов, простейших, поэтому возбудители хронических инфекций, образующие биопленки, также обладают повышенной устойчивостью к воздействию антибиотиков, успешно противостоят антителам, фагоцитам и другим потенциально опасным для них факторам окружающей среды. В течение всего времени своего существования человечество страдало от острых бактериальных инфекций, при которых планктонные клетки специфических (узкоспециализированных) патогенов представляли серьезную опасность для каждого человека. В настоящее время разработаны накцины и антибиотики, способные успешно противостоять подобным заболеваниям, и теперь они находятся под относительным контролем врачей и эпидемиологов. Однако, ряд микроорганизмов, которые эффективно выживали в сложных условиях окружающей среды миллионы лет, например, Pseudomonas spp., сегодня успешно противостоят мерам, применяемым против них современной системой здравоохранения. По всей видимости, существуют пациенты, которые, возможно, по своим генетически предрасположенным сниженным способностям к защите от инфекций, выжили лишь благодаря эпохе применения вакцин и антибиотиков. Сегодня они являются особенно восприимчивыми к этим так называемым условно-патогенным бактериям которые представляют серьезную опасность в качестве этиологических агентов оппортунистических внутрибольничных инфекций. Вперспективе изучение экологических закономерностей возникновения иразвития микробных сообществ (биопленок) является ключевым моментом дальнейшего развития медицинской микробиологии. Инфекции, связанные с биопленками Кнастоящему времени достоверно доказана роль микробных биопленок ввозникновении и развитии таких распространенных заболеваний, как: •инфекции, связанных с катетеризацией сосудов, вызванные Staphylococcus aureus и др. грамположительными микроорганизмами •инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, вызываемые стафилококками •пародонтит, вызываемый рядом микроорганизмов полости рта *• инфекции мочевы водящих путей, вызываемые Е. colt и др. патогенами, •инфекции среднего уха, вызываемые, например Haemophilus influenzae •муковисцидоз, вызываемый P. aeruginosa. Все эти заболевания трудны для лечения, имеют высокую частоту рецидивов и некоторые из них могут явиться причиной летальных исходов. Далеко не до конца ясны механизмы, по которым микроорганизмы, образующие биопленки, вызывают патологические процессы в макроорганизме. В доступной литературе описаны четыре возможных варианта этих механизмов, а именно: 1) отрыв клеток или аггрегатов клеток от растущих на медицинских устройствах биопленок, и выход их в кровяное русло или мочевыводящие пути, 2)синтез микроорганизмами биопленок особых эндотоксинов, 3)повышенная резистентность биопленок к компонентам иммунной системы хозяина 4)появление в биопленке популяции сверхустойчивых к антимикробной терапии микроорганизмов (например, путем обмена плазмидами). Обсудим эти механизмы подробнее. В лабораторных исследованиях показано, что увеличение скорости или изменение направления потока жидкой фазы приводит к отрыву клеток от исходной биопленки [4]. Также показано, что отделение клеток или их аггрегатов от биопленки может быть связано с изменениями концентрации субстрата, который омывает биопленку [11]. В кардиологии подобное отделение от материнской биопленки клеточных аггрегатов чревато возникновением эмболии при закупорке ими просвета сосудов. Ряд клинических симптомов при ИЭ напрямую связан с этим процессом, например, кожные проявления или развитие инфаркт-пневмонии. Целым рядом работ доказано, что биопленки грамотрицательных бактерий находящихся на поверхностях медицинских устройств, синтезируют эндотоксины, которые могут провоцировать иммунный ответ у пациента. В нескольких исследованиях были измерены концентрации эндотоксинов в биопленках [12, 13]. Показано, что общее микробное число в биопленках на гемодиализных трубках коррелировало с концентрациями эндотоксинов [13]. Однако ни в одном из этих исследований не сообщалось о кинетике диффузии эндотоксинов из биопленок и их концентрациях внутри и вне биопленок. Установлено, что экзополисахариды фагоцитарной активности макрофагов [14]. [15], было показано, что фагоциты не
биопленки, выросшие на внедренном в брюшину устройстве. Привитие животные имели 1000-кратный титр антител, но они не достигали бактериальных клеток, заключенных в биопленку. На основании этих данных можно предположить, что отделившиеся от биопленки на медицинском устройстве микроорганизмы с большей легкостью, чем планктонные клетки аналогичного вида, способны преодолеть иммунный барьер и вызвать заболевание. Показано, что бактерии в биопленках могут обмениваться плазмидами, содержащими гены, ответственные за их резистентность к антибиотикам. Обмен плазмидами между различными родами микроорганизмов полости рта описан в исследованиях [16]. Физическая близость клеток в биопленках облегчает обмен плазмидами по тому же механизму, что и среди планктонных микроорганизмов. Показано что обмен плазмидами между разными видами Pseudomonas были значительно выше в биопленках, чем для тех же микроорганизмов во взвешенной культуре. Появление резистентных микроорганизмов особенно опасно в случае их роста и размножения в условиях стационара, поскольку они способны распространяться от пациента к пациенту через руки медперсонала [17]. Микробные биопленки в кардиохирургии В кардиологии и кардиохирургии с биопленками ассоциируются прежде всего такие заболевания, как: 1. инфекционный эндокардит, вызванный развитием биопленок на собственных клапанах пациентов 2.инфекционный эндокардит, связанный с протезными клапанами либо другими имплантатами З.катетер-ассоциированная инфекция, связанная с образованием биопленок Роль биопленок в развитии ИЭ нативных клапанов изучена недостаточно. Микроорганизмы-возбудители ИЭ, поступают в кровяное русло прежде всего через полость рта и желудочно-кишечный тракт. Микроорганизмы плохо прикрепляются к неповрежденному эндотелию. Микротромб, образующийся на месте повреждения эндотелия, значительно облегчает адгезию многих микроорганизмов за счет своих молекулярных и клеточных компонентов, например, фибронектина. Фибронектин, продуцируемый эндотелиальными клетками, тромбоцитами и фибробластами и ответ на повреждение сосудов, был идентифицирован в тромбических повреждениях сердечных клапанов. Он может одновременно связываться как с фибрином, коллагеном и клетками хозяина, так и с бактериями. Некоторые бактерии имеют рецепторы фибронектина, как например, Staphylococcus aureus и несколько видов Streptococcus [18]. На модели лабораторного животного было показано, что Streptococcus sanguis связывается с молекулой фибронектина, при этом мутанты S. sanguis, 11 не связывающиеся с фибронектином, являются менее вирулентными, чем обычные штаммы [19]. Некоторые стрептококки также синтезируют декстраны с высоким молекулярным весом, которые способствуют их адгезии к поверхности тромбов [20]. Соответственно, декстраназы блокировали микробную адгезию у экспериментальных животных [21]. Бактерии проникают в тромбы на эндокарде уже в течение 30 минут после инъекции в полиэтиленовый катетер в сердце кролика [22]. Хотя большинство бактерий поглощались лейкоцитами, некоторые бактерии адгезировались на стенке клапана. В течение нескольких часов эти бактерии начинали размножаться. Микроколонии бактерий развивались прежде всего там, где не было или было немного лейкоцитов. Некоторые микроколонии в течение 24 ч оказывались окруженными фибриновыми капсулами и были таким образом защищены от лейкоцитов. Таким образом, фибрин препятствует антибактериальной деятельности лейкоцитов и тем самым дает возможность микроорганизмам создать биопленки. В основном, метаболическая активность бактерий биопленки проявлялась на поверхности тромба; колонии в глубине тромба были биохимически неактивны [23]. Биопленки на сердечных клапанах могут вызывать повреждение тканей клапана или вызывать эмболию. В исследованиях на кроликах, инфицированных стафилококками, доказано, что бактерии, проникающие в соединительную ткань аортального клапана, вызывают его структурное повреждение [24]. Актуальность проблемы протезного инфекционого эндокардита, либо участие биопленок в развитии инфекций, связанных с другими имплантатами, растет пропорционально развитию кардиохирургии, так как растет потребность в использовании различных синтетических материалов, заплат, механических клапанов, биопротезов и др. Хирургическое внедрение протезного клапана вызывает повреждение окружающих тканей, накопление тромбоцитов и фибрина на прилегающих участках сердца и на имплантате, что облегчает процесс колонизации этих поверхностей для микроорганизмов, циркулирующих в русле кровеносных сосудов. Частота возникновения инфекционного эндокардита при постановке механических или биологических клапанов примерно одинакова [25] и составляет, по разным оценкам, от 0.5-1% [26] до 4 % [27]. По мнению изложенному в [27], протезный эндокардит в основном связан с колонизацией микроорганизмами манжеты протезных клапанов. Микроорганизмы обычно колонизируют кольцо, в которое протезный клапан был вшит, что ведет к отделению клапана от окружающей ткани [28]. Обсуждая вопрос о роли биопленок в генезе ИЭ, остается неясным, как часто наблюдается бессимптомная колонизация протезных клапанов микроорганизмами, в каком проценте случаев и по каким причинам развиваются клинические проявления инфекционного эндокардита, то есть 12 какие факторы ведут к манифестации процесса со всеми негативными последствиями. Теоретически выглядит очевидным, что для микроорганизмов экологически выгодно прикрепление к материалу протезного клапана и использование прилегающей к нему ткани в качестве источника питания. В то же время, к счастью, у большинства пациентов с протезами клапанов сердца и др. имплантатами, благодаря неизвестным пока механизмам, случайно прикрепившиеся бактерии в этом локусе «ведут себя» достаточно пассивно. По-видимому, достигаются какие-то симбиотические отношения, которые не приводят к активному размножению бактерий и, соответственно, не развивается воспалительная реакция. Необходимость изучения экологических оптимумов возникновения и существования микробных биопленок на фазовой границе между абиогенной поверхностью механических протезных клапанов и тканями сердца несомненна. После создания адекватной модели in vitro будет возможен экспериментальный поиск новых методов профилактики и лечения. Значительно более доступны для исследователей внутривенные катетеры, и, соответственно, более подробно изучена роль биопленок в развитии катетер-ассоциированных инфекций. Микроорганизмы, образующие биопленки на катетерах - это прежде всего S.aureus, P.aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Candida albicans [29]. Колонизация катетера и формирование биопленки могут начаться уже в течение первых дней после его установки. Методами электронной микроскопии доказано наличие микробных биопленок на катетерах, причем не только в области просвета катетера, но и на внешней его стороне [29]. Показано, что биопленки на катетерах, установленных на сроки менее 10 дней, формируются в основном на внешней поверхности катетера, а у катетеров, установленных на более длительные сроки (10-30 дней), тенденция была обратной [30]. Поскольку катетер находится в прямом контакте с кровяным руслом, его поверхность покрывается форменными элементами крови и белками (альбумин, фибриноген, фибронектин и т.д.), что облегчает различным микроорганизмов адгезию на материале катетера. Например, S.aureus прикрепляется и к фибронектину, и к фибриногену, и к ряду других белков, а S.epidermidis прикрепляется только к фибронектину [29]. Кроме того, микрорганизмы сами могут синтезировать адгезины, например, у S. epidermidis изучались роль адгезинов (межклеточного адгезина и гемагглютинина) на модели животного. Установлено, дикие штаммы микроорганизмов значительно эффективнее адгезировались на поверхность венозного катетера и вызывали более тяжелое течение заболевания, чем лабораторные штаммы, дефектные по синтезу этих двух адгезинов [31]. На модели in vitro показано, что грамотрицательные микроорганизмы гораздо 13 интенсивнее адгезируются на материалы, покрытые плазменными белками крови [32]. Научный поиск в изучении биопленок, можно сказать, еще в самом начале пути, однако потребность решения практических медицинских задач, связанных с биопленками, давно назрела. Уже известно немало разработок для покрытия синтетических материалов, протезов, имплантируемых устройств. Например, в литературе описан посеребренный механический сердечный клапан, покрытый плотным слоем металлического серебра (silzone), который был разработан для предотвращения адгезии микроорганизмов. Авторы имплантировали этот материал в морскую свинку, зараженную Staphylococcus epidermidis. Оценивая воспаление, они показали, что покрытый silzone материал вызвал меньший воспалительный ответ, чем материал, им не покрытый [33]. Однако, по данным целого ряда авторов [34, 35], серебрение протеза не слишком эффективно. Описан случай, когда, несмотря на покрытие серебром протезного клапана, эндокардит все равно развился, что привело к его замене. Авторы отмечают, что покрытие серебром клапана может быть эффективно in vitro, но in situ это не защищает ткани, окружающие протез, во всяком случае в долговременной перспективе [34]. Что касается венозных катетеров, к настоящему времени предложено несколько стратегий предотвращения развития биопленок. К ним относятся: •использование антибактериальных мазей (например, мупироцина) •уменьшение длины катетера, •использование фильтров для жидкостей, поступающих в катетер, •покрытие стенок просвета катетера антибактериальными препаратами [36]. Однако на практике дополнительное применение антибактериальных агентов не обеспечивает полной защиты от связанных с катетеризацией инфекций [37]. По результатам метаанализа 13 различных клинических исследований (всего 2 830 катетеров), в которых сравнивались обработанные и необработанные катетеры, показано, что венозные катетеры, пропитанные хлоргексидином и сульфадиазином серебра, значительно реже подвергаются колонизации микроорганизмами по сравнению с катетерами без обработки [38]. Рассматривая различные способы обработки венозных катетеров с применением соединений серебра, показано, что хелатироваиные серебром коллагеновые манжеты втрое меньше подвержены колонизации микроорганизмами и четырехкратно снижают частоту бактериемии, чем обычные катетеры, при этом катетеры покрытые только серебром, клинически неэффективны, а катетеры покрытые хлоргексидином и сульфадиазином серебра, обеспечивают недолгую защиту [39]. 14 Однако действительно эффективные практические решения могут быть найдены только после получения ответов на теоретические вопросы, связанные с формированием и функционированием биопленок. 1 2 | |||||||||