продукты NO синтазной активности и дыхательные пути. Продукты NO и дых п. Продукты noсинтазной активности и воспаление дыхательных путей Л. Ю. Каминская, Н. А. Филиппова
 Скачать 64 Kb.
|
|
Продукты NO-синтазной активности и воспаление дыхательных путей: Л.Ю. Каминская, Н.А. Филиппова. Исследования оксида азота и продуктов NO-синтазной активности являются одним из наиболее активно изучаемых направлений в современной медицине. При анализе имеющихся литературных данных не вызывает сомнения роль NO как маркёра аллергического воспаления. Неоднозначность и, зачастую, противоречивость данных различных авторов о влиянии оксида азота на аллергическое воспаление у больных бронхиальной астмой делает актуальными исследования в этой области. Оксид азота – нетипичная сигнальная молекула. Это небольшое газообразное соединение, которое является свободным радикалом (N=O), имеет неспаренный электрон, что придает ему высокую реакционную способность. Оксид азота хорошо растворим в воде и липидах, легко и быстро диффундирует через мембраны. Время жизни NO не превышает 6-10 секунд, после чего он превращается при участии кислорода и воды в нитраты и нитриты. Оксид азота отвечает за широкий диапазон функций: регуляция тонуса сосудов, межклеточная коммуникация, модуляция нейротрансмиссии, регуляция иммунной цитотоксичности, секрецию медиаторов и гормонов. Оксид азота продуцируется различными клетками: эпителиальными, эндотелием сосудов, нейронами и присутствует практически во всех органах и системах. Оксид азота образуется из L-аргинина в результате окисления кислородом гуанидиновой группы при участии фермента NO-синтазы (NOS), в процесс участвуют 5 электронов, источником которых являются восстановленные формы НАДФ. Очищены, клонированы и охарактеризованы на молекулярном уровне 3 изоформы NOS: эндотелиальная (e-NOS, NOS3), неврональная (n-NOS, NOS1) и индуцибельная (i-NOS, NOS2) она же макрофагальная. Неврональная и собственно эндотелиальная изоформы являются конститутивными и поддерживают низкий стационарный уровень NO, который не превышает несколько микромолей и необходим для нейротрансмиссии, поддержания электрической активности нервных клеток, что существенно для сохранения долговременной памяти, вазорелаксации, агрегации тромбоцитов, секреции гормонов, регуляции почечной гемодиномики, электролитного балланса и других физиологических процессов. Индуцибельная форма экспрессируется во многих клетках, в том числе в макрофагах, эозинофилах, лимфоцитах и гладкомышечных клетках после иммунологических стимулов и при воспалении, под действием медиаторов этого процесса - цитокинов и под действием эндотоксинов. При участии этой формы образуется больше количество NO, составляет сотни микромолей и поддерживается в течение от нескольких часов до нескольких дней, что зависит от длительности стимула. В дыхательных путях экспрессируются все 3 типа NО-синтаз. При этом, как показали экспериментальные исследования, базовый уровень оксида азота в выдыхаемом воздухе определяется экспрессией конституциональных синтаз. В альвеолярных клетках экспрессируются NOS3 и, в меньшей степени, NOS1. В альвеолярных клетках в норме существует также и определённый уровень экспрессии индуцибельной синтазы (NOS2). Дальнейшая активация этой изоформы, возникающая под воздействием воспалительных цитокинов, считается основной причиной повышения содержания NO в выдыхаемом воздухе при патологических состояниях, связанных с воспалением дыхательных путей. Наибольший вклад в уровень выдыхаемого NО вносит его продукция эпителиальными клетками, преимущественно нижних дыхательных путей. Эндотелиальная синтаза экспрессируется в клетках лёгочных сосудов (артериального и венозного типа), нейрональная – в неадренергических и нехолинергических ингибиторных нейронов. Высокий уровень NO определяется также и в носовой полости и синусах. Одним из наиболее важных источников NO в выдыхаемом воздухе и тканях являются S-нитрозотиолы, играющие важную роль в секвестрации, высвобождении и транспорте NO к месту проявления биологической активности. Таким образом, NO продуцируется по всей длине дыхательных путей. В проводящих дыхательных путях он секретируется в просвет, где в ходе дыхательного цикла смешивается с NO, секретируемым альвеолами. Уровень NO в верхнем респираторном тракте и синусах значительно выше такового в нижних дыхательных путях. Продуцированный газ легко диффундирует и проникает в клетку-мишень, где он активирует растворимую гуанилатциклазу, с последующей продукцией гуанозин 3'5'циклического монофосфата, который медиирует большинство из эффектов оксида азота (не исключается также возможность прямого действия NO на кальций-зависимые калиевые каналы). В гладких мышцах (сосуды, бронхи) стимуляция гуанилатциклазы и продукция цГМФ приводит к активации цГМФ-зависимой протеинкиназы, снижению концентрации внутриклеточного кальция и миорелаксации. В кровь диффундирует примерно 94% NO, синтезированного в нижних дыхательных путях, в то время как оставшиеся 6% - в просвет дыхательных путей и выделяются с выдыхаемым воздухом, где может быть измерен и в газовой фазе (в норме концентрация оксида азота в выдыхаемом воздухе – 5-10 частиц на биллион). В крови NO превращается в короткоживущий свободный радикал с непарным электроном, который связывается с оксигемоглобином с образованием метгемоглобина и нитрата. Большинство биологических эффектов оксида азота опосредуются взаимодействием с парамагнитными центрами эффекторных протеинов (например, гема). Кроме того, NO· способен вступать в быстрые реакции с другими молекулами, содержащими непарный электрон. Эти реакции включают взаимодействие с метаболитами реактивного кислорода (супероксид-анион ) или с радикалами, входящими в состав протеинов или липидов. Реакция NO с цистеиновыми остатками субъединиц гемоглобина приводит к образованию S-нитрозотиолов. Образование S-нитрозотиолов и S-нитрозопротеинов может также являться следствием реакции NO с другими тиол-содержащими молекулами (цистеин, глютатион). Другой путь превращения оксида азота – соединение с супероксидом – приводит к образованию высокотоксичного и достаточно стабильного пероксинитрита. Кроме того, NO· реагирует с кислородом с образованием нитрогенов. NO и реактивные нитрогены могут индуцировать ряд ковалентных модификаций в различных биомолекулах с образованием нитрозо- и нитро- продуктов, что приводит к функциональным или структурным изменениям. Одним из видов подобной модификации является 3-нитротирозин и вещества, образующиеся вследствие взаимодействия NO с тирозиновыми остатками протеинов. Подобному механизму нитрации подвергаются, в том числе, цитоскелетные протеины (актин, нейрофиламенты) вследствие стимуляции гладкомышечных клеток лёгочного микроциркуляторного русла. В растворе оксид азота также быстро оксидируется в стабильные конечные продукты нитрит и нитрат. Скорость NO- синтазной реакции можно проследить по накоплению суммы окислов азота (NO,NO2,NO3). Определение нитратов основано на их восстановлении до нитритов, которые при этом образует окрашенное соединение с реактивом Грисса, и в такой стабилизированной форме регистрируется спектрофотометрически. В целом, как показали результаты исследований с применением радиоактивных изотопов, 85% от общего уровня NO-содержащих веществ в организме здорового человека составляют нитраты и нитриты, около 10% составляют мембраносвязанные соединения или S-нитрозосоединения. С учётом вышесказанного, избыточная продукция NO· в ходе воспалительного и иммунного ответа в респираторном тракте может также рассматриваться в качестве защитного механизма, хотя «ценой» этой защиты является возможное повреждение респираторного тракта при высоких концентрациях метаболита. Это повреждение обычно связывается с продукцией реактивных нитрогенных субстанций вследствие взаимодействия NO· с частично восстановленными формами кислорода, образующимися в ходе воспалительного процесса. К развитию повреждения лёгкого может привести и нитрация протеинов. С другой стороны, в ряде случаев NO· ослабляет оксидант-индуцированное повреждение лёгких, а ингаляция оксида азота может применяться в качестве терапевтического средства при лёгочной гипертензии и ряде форм респираторного дистресс-синдрома взрослых. Преобладание того или иного путь метаболизма в значительной степени зависит от концентрации оксида азота и локального редокс-статуса. Сходными с оксидом азота свойствами (прежде всего, вазодилататорными) обладают и продукты его метаболизма (S-нитрозопротеины). Последние, при этом, являются являются значительно более долгоживущими (порядка нескольких часов). Другой продукт метаболизма оксида азота – пероксинитрит – является высокотоксичным, индуцируя перекисное окисление липидных мембран клеток и оказывая повреждающее воздействие на ДНК. Пероксинитрит также угнетает ионные каналы эпителиальных клеток и активность лёгочного сурфактанта. Оксид азота продуцируется целым рядом клеток-участников воспаления. Так, индуцибильная NO-синтаза выявлена в макрофагах (в том числе альвеолярных), эозинофилах, нейтрофилах, тучных клетках. При этом у больных БА определяется как увеличение содержания NO в выдыхаемом воздухе, так и увеличение количества альвеолярных макрофагов с положительной окраской на NOS. В альвеолярных макрофагах показано существование двух типов NOS, при этом базальный уровень синтеза (нестимулируемые альвеолярные макрофаги) обеспечивается синтазой эндотелиального типа –eNOS, а индуцибельная изоформа обуславливает увеличение продукции оксида азота клетками после экспозиции к воспалительным стимулам. Повышение экспрессии iNOS и увеличение продукции NO альвеолярными макрофагами индуцируется интерфероном -γ (изолированно или в комбинации с липополисахаридом), интерлейкином-1; аналогичное действие оказывает экспозиция NO на альвеолярные макрофаги. Воздействие NO на альвеолярные макрофаги приводит к повышению ими продукции супероксид-аниона и пероксинитрита, оказывающих повреждающее действие, а также к увеличению нитротирозиновых остатков на макрофагах. При этом повышение продукции NO макрофагами не является специфичным только для аллергического воспаления. Воздействие оксида азота на клеточные механизмы воспаления включает также его влияние на особенности клеточного апоптоза. Имеются также данные об угнетающем влиянии на апоптоз клеток бронхиального эпителия. Заключение: Аллергическое воспаление приводит к активации i-NOS и усилению её экспрессии в эпителии дыхательных путей и клетках-участниках воспаления. Это сопровождается значительным повышением концентрации NO в дыхательных путях и выдыхаемом воздухе, что подтверждается в исследованиях как у человека, так и у различных видов экспериментальных животных . Высокий уровень NO приводит, с одной стороны, к торможению выделения медиаторов из тучных клеток, с другой - к возникновению отёка вследствие возрастания бронхиального кровотока и экссудации плазмы в дыхательных путях. Кроме этого, высокие концентрации NO вследствие активации i-NOS, а также пероксинитрит, образующийся путём взаимодействия NO и кислородных радикалов в ходе аллергического воспаления, могут привести к повреждению эпителия, а также оказывать цитостатический и цитотоксический эффекты. Эти эффекты, играющие важную роль в защите против микроорганизмов и опухолевых клеток, в то же время способствуют развитию повреждения дыхательных путей. Повреждающее действие высоких концентраций NO в отношении клеток и тканей лёгкого, подтверждается нарастанием содержания протеина в БАЛЖ как проявления повреждения альвеолярного эпителия. Другими аспектами повреждающего действия является повреждение эндотелиальных клеток, изменение проницаемости мембран. Описаны изменения ФВД, характерные для отёка мелких бронхов после ингаляции NO здоровыми лицами. Длительная экспозиция экспериментальных животных к низким дозам NO приводит к развитию интерстициального отёка, повреждению клеток артериолярного эндотелия, к парасептальной эмфиземе. Активирующее воздействие NO на процессы перекисного окисления и на параметры «респираторного взрыва» в альвеолярных макрофагах способствуют, с одной стороны, более активной элиминации инфекционных агентов (мыши с врождённым дефицитом i-NOS в большей степени подвержены некоторым инфекциям, например Mycobacteriumtuberculosis, Leishmaniamajor) с другой – могут являться причиной дальнейшего повреждения тканей. Кроме того, воздействие NO на эозинофилы и Th1-клетки способствует дальнейшему прогрессированию аллергического воспаления за счёт привлечения в зону воспаления эозинофилов (а также торможения их апоптоза) и увеличения количества Th-2 лимфоцитов, синтезирующих провоспалительные цитокины. С другой стороны, регулирующее действие высоких концентраций NO на продукцию гистамина и тормозящее действие на тучные клетки, как и индукция им нейтрофильного апоптоза в определённой степени способствуют уменьшению выраженности аллергического воспаления. Угнетение оксидом азота пролиферации гладких мышц сосудов и апоптоза клеток бронхиального эпителия в определённой степени препятствуют развитию процессов ремоделирования, характерных для хронического воспалительного процесса. Таким образом, индукция i-NOS в ходе аллергического воспаления носит определённый защитный характер (действие на тучные клетки, миоциты, апоптоз нейтрофилов). В то же время значительное повышение концентрации NO с преобладанием повреждающего действия, образование активных нитрогенов, а также сдвиг путей метаболизма в сторону повышения продукции пероксинитрита может привести к прогрессированию эозинофильного воспаления, повреждению альвеолярного эпителия и эндотелия сосудов. Одним из основных следствий аллергического воспаления при БА является развитие спазма гладких мышц бронхов. Воздействие оксида азота на этот компонент опосредовано несколькими механизмами: воздействием на аллергическое воспаление, непосредственным бронходилатирующим эффектом за счёт активации гуанилатциклазы гладкомышечных клеток и нейротрансмиттерной ролью NOS1-синтезированным NO в неадренергических нехолинергических бронходилататорных нейронах. Большинство существующих исследований подтверждают бронходилатирующий эффект эндогенного оксида азота, как и его способность уменьшать реактивность дыхательных путей к различным стимулам. Помимо самого NO, сильными релаксантами дыхательных путей являются и некоторые его метаболиты – S-нитрозотиолы. Таким образом, несмотря на неоднозначное действие на аллергическое воспаление у больных БА, его действие на гладкие мышцы бронхов является преимущественно протективным (бронходилатация, уменьшение бронхиальной гиперреактивности). Состояния, не сопровождающиеся аллергическим воспалением, но сопровождающиеся бронхиальной гиперреактивностью (вирус-индуцированная гиперреактивность) ассоциируются со снижением продукции оксида азота. Литература Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы- две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах// Биохимия.-1998.-Т 63.-Вып.7.-С.924-938. Волин М.С., К.А.Дэвидсон, П.М. Камински, и др. Механизмы передачи сигнала оксидант- оксид азота в сосудистой ткани // Биохимия.– 1998.– Т. 63.– Вып7. – С. 958-965. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия – 1998.- Т63.- Вып. 7. – С.1007-1019. Стокле Ж.-К., Б. Мюлле, Р.Андрианцитохайна, А. Клещев. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов// Биохимия.- 1998.– Том 63.– Вып.7 – С.976-983 Стокле Ж.-К., Б. Мюлле, Р.Андрианцитохайна, А. Клещев. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов// Биохимия.- 1998.– Том 63.– Вып.7 – С.976-983. Жлоба А.А. Лабораторная диагностика нарушений свободно-радикального метаболизма// Методическое пособие.- СПб.- Изд.СПбГМУ им. И.П.Павлова.- 2001- С.25-27. Brown A.S., Moro M.A., Masse J.M. et al. Nitric oxide-dependent and independent effects on human platelets treated with peroxinitrite // Cardiovascular Research .–1998. – V.40. – P. 380-388. |