Белки лаб. Работа белки цветные реакции на белки и аминокислоты
 Скачать 340.89 Kb.
|
|
Работа 1. БЕЛКИ Цветные реакции на белки и аминокислоты Цветные реакции на белки происходят в результате взаимодействия ряда химических соединений с функциональными группами радикалов аминокислот, которые входят в состав белков. Радикалы аминокислот в белках, как правило, свободны, так как они в образовании пептидных связей не участвуют. Пептидная связь первичной структуры белка образуется путем взаимодействия карбоксильной группы с аминогруппой следующей аминокислоты. Например: NH 2 – СН – COОН + NH 2 – CH – СООН + NH 2 – СН – СООН СН 3 СН CH 2 OH СН 3 СН 3 NH 2 – СН – CO – NH – CH – СО – NH – СН – СООН + 2Н 2 О СН 3 СН CH 2 OH CН 3 СН 3 Рис.1Трипептид В данном случае образовался трипептид (рис.1) из трех остатков аминокислот: аланина, валина и серина с участием двух пептидных связей: - СО - NH - и выделением воды. Эта связь относится к ковалентным, так как образуется общими электронными парами между атомами. В результате атомы располагаются очень близко друг к другу и сильнее тянутся. Поэтому пептидная связь, как все ковалентные связи, очень прочная. Для ее образования требуется более ста ккал. энергии. Полипептидная цепь белка начинается со свободной аминогруппы и кончается свободной карбоксильной группой: NH 3 +……….СООˉ. Эти группы в водном растворе диссоцируют, принимая заряды, и уравновешивают количество положительных и отрицательных зарядов. Поэтому большинство белков электронейтральны. Однако есть и заряженные белки: положительные и отрицательные. Их заряд зависит от наличия в первичной структуре белка положительно заряженных аминокислот (лизин, гистидин, аргинин) и отрицательно заряженных как глутаминовая и аспарагиновая. Примером отрицательно заряженного белка служит пепсин - фермент желудочного сока. У пепсина много аспарагиновых и глутаминовых радикалов, которые и способствуют преобладанию отрицательных радикалов в молекуле пепсина. Студенту необходимо выписать из учебника формулы аминокислот и правильно их присоединять при помощи пептидной связи. №1.1 Биуретовая реакция на пептидную связь Биуретовая реакция открывает в белке пептидную -С0-NH-, которая образуется при взаимодействии групп — NH ной молекулы и -СООН другой молекулы кислот путём отнятия от них молекулы воды. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей -С0-NH-. При добавлении сернокислой меди к сильно щелочному раствору белка образуются комплексные соединения меди с пептидной группировкой, окрашенные в красно- или сине-фиолетовый цвет. Исследуемый материал: раствор яичного белка. Реактивы: 1.Едкий натр, 10% раствор. 2.Сернокислая медь, 1% раствор. Оборудование: 1. Штатив с пробирками. 2.Капельницы или пипетки. Ход работы К 5 каплям раствора белка (яичный белок, растворённый в воде) прибавляют 3 капли 10% раствора едкого натра '(NaОН) и 1 каплю 1% раствора сернокислой меди (CnSO4) и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовый цвет. Нельзя добавлять избыток сернокислой меди, поскольку синий осадок гидрата окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка. Вывод. №1.2 Нингидриновая реакция на альфа-аминокислоты Нингидриновая реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа- положении, в т.ч. для альфа-аминокислот. Растворы белка, альфа-аминокислот и пептидов дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином при нагревании. Исследуемый материал: раствор яичного белка. Реактивы: 1. Нингидрин, 0,1% водный раствор. Оборудование: 1. Штатив с пробирками. 2. Капельницы. Ход работы К 5 каплям раствора белка приливают 5 капель 0,1% водного раствора нингидрина и кипятят 1-2 минуты. Появляется розово-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание. С течением времени раствор синеет. Данная реакция не является специфичной, поскольку её дают некоторые амины и амиды кислот. Вывод. №1.3 Ксантопротеиновая реакция на циклические аминокислоты Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот - триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих в своём составе бензольное ядро. Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой даёт желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца этих аминокислот с образованием нитросоединении жёлтого цвета. Эта реакция носит название ксантопротеиновой реакции. Желтое окрашивание наблюдается при попадании концентрированной азотной кислоты на кожу, ногти и т.п. Такие белки, как желатина и некоторые другие, не содержащие выше названные циклические аминокислоты, не дают ксантопротеиновои реакции. Ксантопротеиновую реакцию дают также более простые ароматические соединения (например, фенол). Исследуемый материал: раствор яичного белка. Реактивы: 1.Азотная кислота концентрированная. 2.Едкий натр, 10% раствор. Оборудование: 1.Штатив с пробирками. 2.Капельницы. Ход работы К 5 каплям раствора белка добавляют 3 капли концентрированной азотной кислоты (HN0 3 ) и осторожно кипятят. Вначале появляется осадок свернувшегося белка (под влиянием кислоты), который затем окрашивается в желтый цвет при нагревании. После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10% раствор едкого натра (NaОН) до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина. Вывод. №1.4 Реакция Фоля, на аминокислоты, содержащие серу Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, но данной реакции не дает, поскольку сера в нём связана прочно. Реакция состоит в том, что при кипячении белка со щелочью аминокислоты (цистеин, цистин) легко отщепляют серу в виде сероводорода, который с солью свинца дает черный или бурый осадок сернистого свинца. Реактив Фоля состоит из 5% раствора уксусно-кислого свинца [(СН 3 С00) 2 Рb] и избытка 10% раствора NаОН. Интенсивность окраски зависит от количества в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу, и от концентрации белка в растворе. Исследуемый материал: раствор яичного белка. Реактивы: 1. Реактив Фоля. Оборудование: 1.Штатив с пробирками. 2.Капельницы. 3.Оборудование для нагревания пробирок. Ход работы К 5 каплям раствора белка прибавляют 5 капель реактива Фоля. Кипятят и дают постоять 1-2 минуты. При стоянии появляется бурый и чёрный осадок сернистого свинца. Указания к составлению отчёта Полученные результаты всех цветных реакций надо записать в виде таблицы Таблица 1 Цветные реакции на белки № Название реакции Употребляемые реактивы Наблюдаемое окрашивание Что открывается 1 2 3 4 Биуретовая Нингидриновая Ксантопротеиновая Реакция Фоля Выводы по работе... При оформлении протокола, когда невозможно составить таблицу, можно придерживаться такой схемы описания работы: 1. Тема. 2. Цель и значение работы. 3. Принцип и химизм реакций. 4. Техника ее выполнения. 5. Расчеты и выводы по работе. Реакции осаждения белков Радикалы аминокислот, вошедшие в первичную структуру белка, взаимодействуют друг с другом, способствуя самопроизвольной укладке вторичной структуры (в виде спирали), в третичную структуру - клубок. В виде клубка белок уменьшается в размере, хорошо помещается в любой маленькой органелле и хорошо защищается от внутренних факторов клетки. Активные группы белков, вступающие в контакт с другими веществами при биологической функции белков ими выполняемой, располагаются компактно, когда белок принимает третичную структуру в виде клубка. Таким образом, третичная структура белка самая выгодная во всех отношениях, как в пространственном, так и в функциональном плане. Однако эта структура самая неустойчивая и лабильная, так как в ее образовании участвуют слабые нековалентные связи такие как водородная, гидрофобные, ионные и т.д. Только в некоторых белках образуется дисульфидный мостик между серосодержащими аминокислотами, который делает третичную структуру данного белка более устойчивым при денатурации. Денатурация - это необратимое осаждение белка под действием ряда физических (нагревание выше 40°С, радиация, различные длины волн, встряхивание, изменение рН среды) и химических факторов, которые разрушают третичную структуру белка. Белок при этом полностью утрачивает свои функции и физико-химические свойства, прежде всего, растворимость в воде. При этом образуется осадок, который не растворяется в первоначальном растворителе. Необратимое осаждение белков вызывают следующие химические соединения: соли тяжелых металлов, органические и минеральные кислоты, алколоидные реактивы и органические растворители. Поэтому наличие этих соединений в продуктах питания и. в питьевой воде нарушает здоровье человека, что, прежде всего, объясняется нарушением функции белков, так как свои функции белки проявляют только при наличии третичной структуры. При этом механизм денатурации белков под действием физических и химических факторов самый разнообразный, но все они сводятся к разрушению тех или иных нековалентных связей а третичной структуре белка. Нагревание выше 40ºС вызывает разрушение водородных связей, которых очень много в третичной структуре. Под действием органи- ческих растворителей разрушаются гидрофобные связи и водная оболочка белков. Студенту необходимо освоить действия каждого химического соединения на молекулу белка. № 1.5. Осаждение белка при нагревании Почти все белки денатурируют при нагревании (50-55°С и выше). Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства, уменьшается его растворимость (уменьшение гидрофильных свойств ведет к нарушению гидратной оболочки). Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в выпадении в осадок денатурированного при нагревании белка. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке белка, т.е. при такой величине рН, когда коллоидные частицы белка являются наименее устойчивыми. Поэтому для полного осаждения белка при нагревании следует создавать реакцию среды, соответствующую его изоэлектрической точке. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждают в слабокислой среде, белки, обладающие щелочными свойствами - в слабощелочной. В сильно кислых (за исключением азотной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот) и сильно щелочных растворах, денатури- рованный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как частицы белка перезаряжаются (или происходит усиление имеющегося заряда). В первом случае белок несет положительный, во втором – отрицательный заряд, что повышает его устойчивость в растворе в результате электростатических сил отталкивания. Поэтому в сильно кислых и щелочных растворах белки обычно не выпадают в осадок при нагревании. Однако в сильно кислых растворах белки при нагревании могут коагулировать при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли. Степень влияния ионов нейтральных солей на осаждаемость белка зависит от их способности адсорбироваться на частицах белка. Адсорбированные ионы соли (если они противоположны по знаку коллоидной частицы) нейтрализуют заряд частицы, наступает момент, когда силы притяжения между молекулами превышают силы отталкивания, ибелок выпадает в осадок. Исследуемый материал: 1% раствор яичного белка. Реактивы: 1. Уксусная кислота,1% раствор; 2. Уксусная кислота, 10 % раствор; 3. NaCl, насыщенный раствор; 4. NaOH, 10% раствор; Оборудование: пробирки, пипетки, спиртовка. Ход работы В 5 пронумерованных пробирок наливают по 10 капель 1% раствора яичного белка. Содержимое первой пробирки нагревают на газовой горелке. Жидкость мутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд, они удерживаются во взвешенном состоянии (яичный альбумин является кислым белком и в нейтральной среде заряжается отрицательно). В пробирку 2 добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают. Выпадает осадок белка, вследствие того, что белок теряет заряд и приближается к изоэлектрическому состоянию. В пробирку 3 добавляют 1 каплю 10 % раствора уксусной кислоты и содержимое нагревают. Осадка белка не образуется даже при кипячении, так как в сильно кислой сpеде частицы белка перезаряжаются, приобретая положительный заряд, В пробирку 4 добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия. Образуется осадок вследствие адсорбции ионов хлорида натрия (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации положительного заряда на частицах белка. В пробирку 5 добавляют 1 каплю 10% раствора едкого натра и нагревают. Осадок не образуется даже при кипячении, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частице белка усиливается. Результаты работы вносят в таблицу. Таблица 2 Осаждение белка при нагревании в различных рН среды Нейтра льная среда Слабок ислая среда (1% СH 3 COOH) Кислая среда (10% СH 3 COOH) Кислая среда + электролит (10% СH 3 СO OH +NaCl) Щелочн ая среда (10% NaOH) Выводы по работе №1.6. Осаждение белка органическими растворителями Белки нерастворимы во многих органических растворителях (спирт, ацетон, эфир и др.). Однако их осаждение происходит только из нейтральных и слабокислых растворов и особенно полно в присутствии электролитов (ионы соли связываются коллоидными частицами белка и снимают заряд). Органические растворители дегидратируют частицы белка (разрушают водную оболочку) и тем самым понижают их устойчивость в растворе. Кратковременное воздействие органических растворителей сохраняет белок в естественном состоянии; при продолжительном взаимодействии со спиртом белок подвергается денатурации. Исследуемый материал: 1% раствор яичного белка. Реактивы: Этиловый спирт или ацетон; NaCl, насыщенный раствор. Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы В пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного белка и 20 капель спирта или ацетона; раствор мутнеет. При добавлении нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия выпадает осадок белка. №1.7. Осаждение белка концентрированными минеральнымикислотами Осаждение белка концентрированными минеральными кислотами (кроме Н 3 РО 4 ) объясняется как явлениями дегидратации белковых частиц и нейтрализацией их зарядов, так и рядом других причин (например, образованием соли и др.). В избытке серной или соляной кислот, а также при их длительном воздействии выпавший осадок денатурированного белка растворяется, по-видимому, за счет перезарядки белка и частичного гидролиза. В избытке азотной кислоты этого растворения не происходит (точный механизм этого явления не установлен; возможно, что ион О 3 мешает перезарядке белковой молекулы). Реакция осаждения белка азотной кислотой используется при клинических исследованиях мочи на присутствие и количественное содержание в ней белка. Исследуемый материал: 1% раствор яичного белка. Реактивы: 1. Серная кислота, концентрированная; 2. Соляная кислота, концентрированная; 3. Азотная кислота, концентрированная. Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы: В три пробирки наливают по 15-20 капель концентри- рованной соляной, серной и азотной кислот. Затем, наклонив пробирки под углом 45°, осторожно по стенке (чтобы жидкости не смешивались) наливают равный объем раствора белка. На границе двух слоев жидкости появляется осадок белка в виде тонкой пленки. Осторожно встряхивая пробирки, обнаруживают растворение осадка белка в случае осаждения соляной и серной кислотами, в пробирке с азотной кислотой белок не растворяется. №1.8. Осаждение белка органическими кислотами Белки из растворов могут осаждаться органическими кислотами, однако различные органические кислоты неодинаково действуют на белок. Трихлоруксусная (СCl 3 СООН) и сульфосалициловая кислоты НО – – SO 3 H COOH являются очень чувствительными и специфическими реактивами на белок и поэтому широко используются в клинической практике для доказательства наличия белка в биологических жидкостях (моча, экссудаты, транссудаты и др.), т.е. применяются в диагностических и прогностических целях. Органические кислоты используется, кроме того, при определении остаточного азота в сыворотке крови, который является важным показателем интенсивности протекающих в организме человека обменных процессов. При ряде заболеваний (инфекционные, гиперфункция щитовидной железы, рак и др.) наступает резкое усиление процессов распада белков, следствием чего является увеличение количества остаточного азота в крови, для определения которого используется трихлоруксусная кислота. Сульфосалициловая кислота осаждает не только белки, но и высокомолекулярные полипептиды. Механизм осаждения белков органическими кислотами объясняется дегидратацией белковой молекулы и снятием заряда. Исследуемый материал: 1% раствор яичного белка. Реактивы: 1. Сульфосалициловая кислота, 10% раствор; 2. Трихлоруксусная кислота, 10% раствор. Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы. В две пробирки наливают по 5 капель 1% раствора белка, в одну пробирку добавляют 1-2 капли 10% раствора сульфосалициловой, в другую 1-2 капли 10% раствора трихлоруксусной кислоты. В пробирках образуется осадок белка. №1.9. Осаждение белка солями тяжелых металлов При действии солей тяжелых металлов на растворы белка происходит денатурация белковой молекулы. Осаждение, денатурированного белка обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимых комплексов. Свойства белков связывать тяжелые металлы используются в меди- цинской практике: белки применяют в качестве противоядия при отравлении солями ртути, свинца, меди и другими металлами. Белок ограничивает всасывание тяжелого металла, образуя с ним нерастворимые комплексы. Следует отметить, что при осаждении белков некоторыми солями тяжелых металлов, например, уксуснокислым свинцом и сульфатом меди, избыток этих солей ведет к растворению (пептизации) первоначально образовавшегося осадка, что связано с адсорбцией тяжелого металла на поверхности коллоидных частиц и появлением положительного заряда на молекуле белка. При избытке солей серебра и ртути пептизации не наблюдается. Исследуемый материал: 1% раствор яичного белка. Реактивы: 1. Сульфат меди, 7% раствор; 2. Уксуснокислый свинец, 5% раствор; 3. Нитрат серебра, 5% раствор. Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы В три пробирки вносят по 5 капель 1% раствора яичного белка и по одной капле в первую пробирку 7% раствора сульфата меди, во вторую - 5% раствора уксуснокислого свинца, в третью - 5% нитрата серебра. Во всех пробирках образуется осадок. В первую пробирку добавляют еще 5-10 капель 7% раствора сульфата меди, при этом наблюдается растворение осадка. В третью пробирку вносят 5-10 капель 5% раствора нитрата серебра. Растворение осадка не происходит. Результаты работы заносят в таблицу. Таблица 2 Реакции осаждения белка Название групп осадителей Употребляемые реактивы Характер и цвет осадка Чем обусловлена реакция 1. Органические растворители 2. Концентрирова нные минеральные кислоты 3. Органические кислоты 4. Соли тяжелых металлов |