микроба модуль. Реакция агглютинации на стекле
 Скачать 176.65 Kb.
|
|
Реакция агглютинации на стекле На обезжиренное предметное стекло наносят каплю взвеси стафилококков, каплю любой другой культуры и каплю физраствора. Капли на стекло наносят гак, чтобы между ними было расстояние. Восковым карандашом на стекле помечают, где какая капля. Во все капли добавляют по одной капле сыворотки, физраствор является контролем. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 минут. Контроль останется прозрачным, в первой капле должны появиться хлопья агглютината, следовательно, здесь есть антитела, а во второй капле появится муть, в этом случае результат реакций считают положительным. При отрицательном результате реакции в первой капле будет видна равномерная муть. Развернутая РА по типу Грубера Развернутую РА ставят с одной сывороткой, реагировавшей предварительно в ориентировочном опыте. Иногда микроб агглютинируется двумя сыворотками. В таком случае развернутую реакцию ставят с каждой из этих сывороток. Для выполнения развернутой РА необходимо использовать такие агглютинирующие сыворотки, которые позволяли бы минимизировать ошибки в трактовке результатов реакции. В этом случае более достоверные результаты при определении вида или типа микробов дают монорецепторные или типоспецифические сыворотки, из которых максимально удалены групповые антигены. Получают данные сыворотки путем истощения групповых антител в реакции Кастеллани.  Определение антител в реакции агглютинации и пассивной агглютинации Для определения нормальных антител берут у здорового человека шприцем кровь из локтевой вены в количестве 2-3 мл и дают ей свернуться. Образовавшийся сгусток отделяют, а сыворотку отсасывают в чистую пробирку и готовят ряд разведений от 1:10 до 1:160 следующим образом: во все пробирки разливают по 1 мл (20 капель) физиологического раствора, затем в 1-ю пробирку этой же пипеткой наливают 1 мл сыворотки, разведённой 1:5, перемешивают с физиологическим раствором, получают разведение 1:20. Также получают разведения 1:40, 1:30 и 1:160. В отдельную контрольную пробирку и наливают 1 мл физиологического раствора без сыворотки (контроль антигена). Во все пробирки закапывают по 2 капли брюшнотифозного ди-агностикума. Штатив ставят в термостат на 2 часа при 37 °С, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре. При учёте реакции сначала просматривают контрольную пробирку. В ней при лёгком встряхивании наблюдается равномерное помутнение, хлопьев не должно быть. Опытные пробирки просматривают одновременно с контрольной, держа в одной руке и встряхивая. При положительной реакции обнаруживаются хлопья из склеенных бактерий. Учитывают максимальное разведение сыворотки, при котором произошла отчетливая агглютинация (титр сыворотки). Этапы выделения чистой культуры: 1-й день - получение изолированных колоний. Каплю исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочной наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпателем втирают материал в поверхность среды; не прожигая и не перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а затем на 3-й чашке. При таком посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше. Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия хлорида. 2-й день - изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает сплошной рост - выделить изолированную колонию не удается. На поверхности агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда в стереоскопическом микроскопе (см. главу 31). Нужную колонию отмечают со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат. Внимание! Пересевать можно только изолированные колонии. 3-й день - изучают характер роста на скошенном агаре. Делают мазок, окрашивают его и, убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из определенного источника и изученная культура, называется штаммом. При выделении чистой культуры из крови (гемокультуры) ее предварительно "подращивают" в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1:10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через большее время в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб делают высевы на чашки для получения изолированных колоний. При необходимости повторяют высевы с интервалами 2-3 дня. Вакцины, сыворотки В настоящее время для предупреждения инфекционных болезней методом искусственного создания невосприимчивости людей имеется большое количество вакцин и сывороток. Вакцины– это препараты из микробных клеток или их токсинов, применение которых называется вакцинацией. Через 1-2 недели после введения вакцин в организме человека появляются антитела. Вакцинопрофилактика – основное практическое назначение вакцин. Современные вакцинные препараты разделяются на 5 групп: 1. Вакцины из живых возбудителей с ослабленной вирулентностью (против оспы, сибирской язвы, бешенства, туберкулеза, чумы, кори, эпидемического паротита и др.). Это наиболее эффективные вакцины. Они создают длительный (на несколько лет) и напряженный иммунитет. Введенный ослабленный живой возбудитель размножается в организме, что создает достаточное количество антигена для выработки антител. 2. Вакцины из убитых микробов приготовлены против брюшного тифа, холеры, коклюша, полиомиелита и др. Длительность иммунитета 6-12 месяцев. 3. Химические вакцины – это препараты не из цельных микробных клеток, а из химических комплексов их поверхностных структур (против брюшного тифа, паратифов А и В, столбняка). 4. Анатоксины готовят из экзотоксинов соответствующих возбудителей (дифтерийный, столбнячный, стафилококковый, газовой гангрены и др.). 5. Ассоциированные вакцины, то есть комбинированные (например, АКДС – ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина). Сыворотки чаще применяются для лечения (серотерапии) инфекционных больных и реже – для профилактики (серопрофилактики) инфекционных заболеваний. Чем раньше вводят сыворотку, тем эффективнее ее лечебное и профилактическое действие. Продолжительность защитного действия сывороток 1-2 недели. Сыворотки готовят из крови переболевших инфекционной болезнью людей или путем искусственного заражения микробами животных (лошадей, коров, ослов). Основные виды: 1. Антитоксические сыворотки нейтрализуют яды микробов (противодифтерийная, противостолбнячная, противозмеиная и др.). 2. Антимикробные сыворотки инактивируют клетки бактерий и вирусы, применяются против ряда болезней, чаще в виде гамма-глобулинов. Гамма-глобулины из человеческой крови имеются против кори, полиомиелита, инфекционного гепатита и др. Это безопасные препараты, так как в них нет возбудителей болезней, балластных ненужных веществ. Гамма-глобулины готовят и из крови гипериммунизированных лошадей против сибирской язвы, чумы, оспы, бешенства и др. Эти препараты могут вызвать аллергические реакции. Иммунные сыворотки содержат готовые антитела и действуют с первых минут после введения. Интерферон занимает промежуточное положение между общими и специфическими механизмами иммунитета, так как, образуясь на введение в организм вируса одного типа, он активен и против других вирусов. Культуральные характеристики Культуральную характеристику роста бактериальных колоний на питательной среде дают после их визуального осмотра. Они могут иметь массу морфологических и культуральных различий, кроме того, способны меняться с течением времени. Молодые и старые колонии бактерий всегда описывают по культуральным свойствам отдельно:
Биохимические свойства микробов По биохимическим признакам бактерий исследуют их отношение к кислороду, ферментативную активность, способность расщеплять различные углеводы, накапливающиеся продукты метаболизма. Отношение к кислороду воздуха. По отношению к кислороду воздуха микроорганизмы делят на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Об отношении бактерий к кислороду судят по росту культуры при посеве уколом в столбик с питательным агаром. Аэробы развиваются в верхней части укола, анаэробы – в нижней части, а факультативные анаэробы – равномерно по всему уколу. Среди биохимических свойств культуры наиболее важно определение их ферментативной активности. Использование углеводов и спиртов культурами микроорганизмов определяют путем посева 0,1–0,2 см3 суспензии исследуемых клеток в пробирки с жидкой или полужидкой средой, содержащей углевод и индикатор. Для обнаружения образования газа при расщеплении углеводов в жидкую среду опускают поплавки. Набор сред с углеводами и индикатором называют «цветным» рядом Гисса. Название «цветной» ряд связано с тем, что под действием ферментов клеток одни сахара расщепляются с накоплением кислоты или щелочи, за счет чего изменяется цвет индикатора и среды, другие сахара не расщепляются, и цвет среды не изменяется. Короткий ряд Гисса включает среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В длинный ряд дополнительно вводят среды с арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой и др., полисахариды (инулин, крахмал, декстрин), спирты (глицерин, дульцит, инозит). Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре. Результаты учитывают через 2–4 суток (для медленно растущих микроорганизмов через 7–10 суток). Отмечают изменение цвета индикатора или отсутствие изменения цвета среды, а также появление или отсутствие газа в поплавке. На основании полученных данных делают вывод, какие сахара ассимилирует исследуемая культура бактерий. Протеолитическая активность. Микроорганизмы, обладающие протеолитической активностью, разжижают желатину, пептонизируют молоко. Для определения этого признака культуру исследуемых бактерий засевают уколом в пробирки с желатиной и культивируют в течение 4–10 сут. при комнатной температуре, отмечая при этом скорость разжижения и его характер: послойный, воронкообразный, пузырчатый и т.п. (рис. 31). Каталазная активность. Фермент каталазу образуют многие аэробные микроорганизмы. Для проведения исследования каплю 10 %-го раствора пероксида водорода наносят на 24-часовую колонию микроорганизма, выросшую на плотной среде в чашке Петри. Выделение кислорода в виде пузырьков газа свидетельствует о наличии в клетках бактерий каталазы. Характер роста в молоке. Обезжиренное молоко разводят водой в соотношении 4:1, добавляют индикатор бромкрезоловый пурпурный (2 см3 1,6 %-го спиртового раствора на 1 дм3 молока) или лакмус (10 см3 4 %-го раствора на 1 дм3 молока), разливают в пробирки по 8–10 см3 и стерилизуют в автоклаве при 0,05 МПа в течение 20 мин. Пробирки с молоком засевают исследуемой культурой бактерий и культивируют 6–14 сут. при оптимальной температуре. Образование микроорганизмами кислот при расщеплении лактозы отмечают по изменению цвета индикатора. Если кислота накапливается в значительном количестве, то образуется сгусток. Бактерии, обладающие активными протеазами, расщепляют казеин, вызывая пептонизацию молока. Образование индола. Некоторые микроорганизмы обладают способностью расщеплять аминокислоту триптофан с образованием индола, что также является диагностическим признаком при определении вида бактерий. Для определения индола применяют метод Мореля. Пробирки с 8–10 см3стерильного мясопептонного бульона с добавлением 0,01 % триптофана (или без него) засевают исследуемой культурой бактерий. Под ватной пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную щавелевой кислотой. Пробирки инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 ч. При образовании индола нижняя часть полоски окрашивается в розовый цвет. Образование аммиака. Аммонификация белковых веществ под влиянием ферментов микроорганизмов сопровождается выделением аммиака. Эту способность бактерий устанавливают путем засева исследуемой культуры в пробирки с мясопептонным бульоном, которые инкубируют в термостате при 37 °С в течение 2–3 сут. Образование аммиака устанавливают по изменению окраски полоски лакмусовой бумажки, укрепленной между пробкой и горлышком пробирки так, чтобы полоска не касалась питательной среды. Выделение аммиака определяется изменением цвета лакмусовой бумажки из красного в синий. Образование сероводорода. При расщеплении микроорганизмами серосодержащих аминокислот (цистеин, метионин) образуется сероводород. Для определения образования сероводорода пробирки с мясопептонным бульоном засевают исследуемой культурой бактерий и под пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором ацетата свинца. Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре на 7–10 сут. Выделение сероводорода фиксируют по почернению полоски вследствие образования сернистого свинца. |