Серологические методы диагностики. Серологические методы диагностики текст. Слайд 1 Серологические методы диагностики заболеваний. Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний основана на выявлении антител в организме пациента к возбудителю инфекции методами серологических исследований.
 Скачать 290.51 Kb.
|
|
СЛАЙД 1 Серологические методы диагностики заболеваний. Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний основана на выявлении антител в организме пациента к возбудителю инфекции методами серологических исследований. В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунных комплексов, которые можно обнаружить в тестах in vitro. СЛАЙД 2 Серологический метод представляет собой совокупность реакций, основанных на взаимодействии антиген (АГ) – антитело (АТ) и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма антител к антигенам возбудителей инфекционных болезней, либо собственно микробных антигенов. Серологические реакции применяются в двух направлениях. 1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитела, антиген) неизвестным является сыворотка крови. Постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами (диагностикумами). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании “парных” сывороток крови больного, взятой в первые дни болезни и через разные промежутки времени от начала заболевания. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение. 2. Установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Для этой цели используются диагностические иммунные сыворотки, полученные от животных после вакцинации соответствующими антигенами. Это серологическая идентификация микроорганизмов. При инфекционных заболеваниях серологические исследования для обнаружения специфических антител являются более доступным методом лабораторной диагностики, чем бактериологическое выявление возбудителя. В ряде случаев серологические исследования являются единственным методом диагностики инфекционных заболеваний. СЛАЙД 3 Серологический метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Большинство реакций этого метода просты в проведении и учете, доступны широкому кругу лабораторий, как правило, безопасны, экономичны, поддаются стандартизации. СЛАЙД 4 К недостаткам серологического метода можно отнести: 1) косвенный характер результата, когда об этиологии болезни судят не по выделению возбудителя, а по ответу (иммунному) организма на возбудитель; 2) необходимость парентерального вмешательства в организм больного; 3) в большинстве случаев позднюю постановку диагноза, что объясняется природной динамикой гуморального иммунного ответа; 4) возможность принять анамнестические Ат (как результат ранее перенесенного заболевания или вакцинации) за Ат к текущей инфекции. При определении микробных антигенов 3-ий и 4-ый недостатки отсутствуют, но необходимо учитывать особенности циркуляции антигенов 6 разных микробов и соотносить эти особенности с возможностью взятия материала для исследования. СЛАЙД 5 1) Взятие материалов для исследования. 2) Выбор серологической реакции зависит от цели исследования, предполагаемого заболевания, фазы болезни, материала для исследования, чувствительности реакции, возможностей конкретной лаборатории. Для выявления Ат, а также Аг используют реакции агглютинации (РА), пассивной гемагглютинации (РПГА), иммунофлюоресценции (РИФ), торможения гемагглютинации (РТГА), преципитации, флоккуляции, реакцию связывания комплемента (РСК) и др. 3) Постановка серологической реакции. Серологические реакции протекают in vitro в две фазы: специфическая - фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут; неспецифическая - фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов. 4) Регистрация серологической реакции с целью определения присутствия серологических маркеров инфекции. СЛАЙД 6 В большинстве случаев материалом является сыворотка крови. Ее получают после образования сгустка крови, кровь следует забирать в строго асептических условиях по стандартной методике. Сыворотку крови относительно долго можно хранить в замороженном состоянии. При некоторых заболеваниях материалом для исследования могут служить ликвор, моча, фильтрат испражнений, промывные воды бронхов, полости рта, глотки, носа и т. д. СЛАЙД 7 1) так как любые серологические реакции являются реакциями взаимодействия АТ и АГ, то во всех случаях для установления присутствия АТ в исследуемом субстрате необходим набор известных стандартных корпускулярных или растворимых АГ, называемых диагностикумами. В свою очередь, для установления присутствия АГ нужен набор иммунных диагностических сывороток; 2) взаимодействие АГ и АТ осуществляется только в присутствии электролита, в качестве которого обычно используют изотонический раствор хлорида натрия или буферные смеси, рН системы должен быть около 7,3; 3) для образования комплекса АГ–АТ требуется период инкубации при особых температурных условиях (от +4 С до +37 С). Образование специфического иммунного комплекса происходит быстро; видимого простым глазом феномена (агглютинации, лизиса и др.) – медленно, через несколько часов или даже суток; 4) оба компонента серологической реакции (антиген и антитела) должны присутствовать в эквивалентном соотношении. Избыток какого-либо из компонентов блокирует образование комплекса АГ–АТ и способствует ложно отрицательным результатам. В процессе оценки серологического метода часто возникает необходимость отличить специфическую реакцию (на видовые и типовые АГ) от группоспецифической (на межвидовые АГ) и иммунный ответ на текущую инфекцию – от иммунного ответа на перенесенное ранее заболевание и иммунизацию. В первом случае дифференциация основывается на использовании монодиагностикумов, скорости нарастания титра АТ, которая выше к специфическим АГ, реакции адсорбции АТ избытком АГ, легкости диссоциации иммунного комплекса под влиянием диссоциирующих факторов. Во втором случае для дифференциации применяют темпы нарастания титра АТ, которые выше при текущей инфекции, особенности проявления реакции и классов иммуноглобулинов, сопоставление результатов серологического метода с бактериологическими и клиническими данными. СЛАЙДЫ 8-9 Слайд 8. Осуществляют визуально, иногда с помощью лупы. Слайд 9. Суть учета серологической реакции сводится к определению феномена связывания АГ и АТ по образованию комплекса АГ– АТ. Визуально образование комплекса АГ–АТ сопровождается двумя основным феноменами – агглютинацией и преципитацией. Различия между ними определяются особенностями антигенов и антител, специфичных к ним. В то же время среди микробных антигенов присутствуют и такие, которые индуцируют синтез непреципитирующих антител, образование комплекса АГ– АТ в данном случае не сопровождается ни феноменом агглютинации, ни феноменом преципитации, а выявление факта образования комплекса АГ–АТ требует маркирования диагностического компонента реакции специальными метками, либо перевода диагностического антигена в другое агрегатное состояние. СЛАЙДЫ 10-11 Слайд 10. При оценке серологических реакции используют следующие критерии: 1) наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.); 2) диагностический титр, 3) нарастание титра АТ в течение болезни в 4 раза и более. Наличие реакции устанавливают по визуальным феноменам или по связыванию иммунохимического маркера. Для оценки интенсивности серологической реакции используют принцип 4 «+». Слайд 11. Принцип 4 «+». СЛАЙД 12 Особый вопрос заключается в количественном выражении результатов серологической реакции. Диагностика инфекционных болезней предполагает не только определение факта присутствия антител (антитела могут быть маркёром протекающего инфекционного заболевания и поствакцинального иммунитета, а также маркёром перенесенного в прошлом заболевания), но и установление их количества. С этой точки зрения в настоящее время присутствуют две равноправные возможности. Первая возможность касается непосредственного определения количества антигенспецифических антител, выражаемого в системе г/л. Для этого тест-система для постановки серологической реакции должна иметь специальный образец-стандарт с уже известным содержанием антигенспецифических антител. Данный стандарт используется для построения калибровочного графика. Однако в силу технологических проблем при приготовлении стандартов названный подход используется лишь в ограниченном числе тест-систем. Чаще применяют вторую возможность – определение количества АТ в виде титра. Для определения тира АТ (или титра АГ) необходимо поставить серологическую реакцию, приготовив ряд разведений сыворотки крови или иного материала (раститровать). При приготовлении разведений сыворотки крови используют раствор электролита (чаще всего изотонической раствор хлорида натрия). Шаг разведения (титрования) задается соотношением объема раствора электролита и объема сыворотки крови. Например, при последовательных разведениях с шагом в 2 раза в 1-й пробирке смешиваются равные объемы раствора электро- 10 лита и сыворотки крови, при шаге в 5 раз к 4-м объемным частям раствора электролита добавляют 1 объем сыворотки, при шаге в 10 раз – к 9 объемам раствора электролита добавляют 1 объем сыворотки крови. Соответственно, титр – это максимальное разведение исследуемого материала, дающее положительный (не менее ++) результат серологической реакции. Титр АТ (или АГ) выражается разведением исследуемого материала, например, 1 : 16, 1 : 250 и т. п. Диагностический титр – это титр антител, характерный для большинства случаев конкретного инфекционного заболевания, определяемый на пике гуморального иммунного ответа. Диагностический титр определяется путем многочисленных исследований, выполняемых на базах различных лабораторий. В то же время существует ряд ситуаций, когда подтверждение диагноза инфекционного заболевания с помощью диагностического титра невозможно: 1) если определение титра антител осуществляется ранее, чем развивается гуморальный иммунный ответ, то, естественно, титр антител будет ниже диагностического, 2) при перенесении заболевания или после вакцинации в прошлом (в анамнезе), 3) при инфекциях, вызванных условно-патогенными микробами, в частности представителями нормальной микрофлоры. В этих случаях для подтверждения диагноза инфекционной болезни используется понятие «нарастание титра антител», то есть оценивается динамика гуморального иммунного ответа. Критерием развития гуморального иммунного ответа является нарастание титра антител за 10–14 дней в 4 и более раз. Соответственно, для определения нарастания титра антител исследованию подвергаются 2 образца сыворотки крови, взятых с указанным интервалом. СЛАЙД 13 Реакция агглютинации (РА) представляет собой один из способов выявления антигена/антител по принципу нахождения известного по неизвестному. В случае нерастворимости антигена (его корпускулярности) при добавлении к нему специфичных антител происходит формирование комплекса «антиген–антитело» в виде белкового агломерата. Этот феномен получил название агглютинации. Основное преимущество реакции агглютинации – возможность визуального учета и простота постановки. С другой стороны, в сравнении с более современными способами выявления антиген/антитела чувствительность реакции агглютинации невысока. Существуют различные варианты РА: 1) пробирочные и на стекле, 2) объемные и капельные, 3) количественные и качественные, 4) обычные, ускоренные и экспресс-реакции Области применения РА связаны с необходимостью индентификации микробных культур, антигенов клеток крови (А, В, 0), а также с определением наличия и титра антител или антигенов в сыворотке крови в практике инфекционных болезней. Компоненты РА: 1) диагностический компонент – антиген в виде суспензии в случае поиска антител, то есть диагностикум, или раствор антител при необходимости идентификации антигена, диагностическая сыворотка. В случае РА чаще диагностикум называют агглютиногеном, а диагностическую сыворотку – агглютинином; 2) исследуемый материал – микробная культура в виде суспензии или выросшей на скошенном агаре клетки крови (эритроциты при определении антигенов по системе А, В, 0), сыворотка крови пациента при диагностике инфекционного заболевания или сыворотка крови лабораторного животного при постановке биологического/иммунологического эксперимента; 3) раствор электролита в качестве среды для разведения ингредиентов реакции и в качестве среды для постановки реакции. Обычно используют 0,15 М (0,85 %) раствор хлорида натрия, реже – другие прописи. Лабораторная посуда и необходимое оборудование: 1) пробирки или предметные стекла для самой реакции (иногда нужны особые блюдца или другие предметы, например, для определения группы крови), 2) пипетки стеклянные или автоматические дозаторы с наконечниками, 3) термостат или холодильник, поскольку все возможные варианты РА 12 проводятся при разных температурных режимах, 3) источник света и черная поверхность для лучшей визуализации результата РА. Схема постановки РА: 1) приготовление разведений исследуемого образца, 2) внесение разведений в пробирки или нанесение их на стекло, 3) добавление диагностического компонента, 4) инкубация при необходимых температурных условиях, 5) регистрация результатов. Регистрация результатов РА проводится по системе 4+ в процессе визуального осмотра. СЛАЙД 14 Название реакции означает, что феномен агглютинации формируется при участии вспомогательных частиц, пассивно или непрямым способом. РПГА проводится для регистрации взаимодействия антиген–антитело в том случае, когда антиген водорастворим и при его связывании со специфическими антителами не происходит образования крупных видимых глазом агломератов. Но если такой водорастворимый антиген неспецифически сорбировать на каких-либо частицах, то проводимая реакция приобретает все характерные для реакции агглютинации черты. Чаще всего для постановки РПГА применяют эритроциты барана или частицы латекса диаметром 3–5 мкм. При использовании эритроцитов барана в качестве носителя диагностического компонента реакцию называют реакцией пассивной гемааглютинации или реакцией непрямой гемагглютинации – РПГА или, соответственно, РНГА. При использовании частиц латекса реакцию пассивной агглютинации называют реакцией латекс агглютинации – РЛА. Основные области применения РПА: определение эффективности поствакцинального иммунитета (определение уровня специфических антител после вакцинации), диагностика инфекционных болезней (определение титра антител или присутствия в биологических средах пациента антигенов микроорганизма, являющегося причиной заболевания), диагностика аутоиммунных заболеваний (например, определение ревматоидного фактора). Компоненты РПА: 1) диагностический компонент. Диагностикум, представляющий собой антиген, сорбированный на эритроцитах барана, в этом случае называется эритроцитарным диагностикумом. А если для сорбции антигена используют частицы латекса, то диагностикум называют латексным. В случае определения антигена по известным антителам на частицах (эритроцитах или латексе) необходимо сорбировать диагностические антитела, тогда диагностическая сыворотка называется эритроцитарным (латексным) антительным диагностикумом; 2) исследуемый материал – сыворотка крови пациента при диагностике инфекционных или аутоиммунных заболеваний или сыворотка крови лабораторного животного при постановке биологического/иммунологического эксперимента; 3) раствор электролита в качестве среды для разведения ингредиентов реакции и в качестве среды для постановки реакции. Обычно используют 0,15 М (0,85 %) раствор хлорида натрия, реже – другие прописи. Лабораторная посуда и необходимое оборудование: аналогичное РА. Схема постановки и учет результатов РПА аналогичны РА. СЛАЙД 15 Реакция связывания комплемента (РСК). Некоторые микроорганизмы, а точнее их антигены индуцируют образование антител, обладающих способностью связывать комплемент, вызывая вместе с соответствующим антигеном возникновение комплекса «антиген–антитело– комплемент». Такие антитела называются комплементсвязывающими и их можно идентифицировать в серологической реакции – реакции связывания комплемента (РСК). Таким образом, РСК применяется преимущественно для диагностики инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать специфические искомому антигену антитела и регистрировать их титр. Схема постановки РСК. РСК относится к сложным многокомпонентным серологическим реакциям. При постановке РСК in vitro создаются диагностическая и индикаторная системы. Диагностическая система включает антиген (диагностикум), исследуемую сыворотку крови пациента, содержащую искомые антитела и комплемент. Все три ингредиента смешиваются в определенных пропорциях и инкубируются. Во время инкубации происходит образование комплекса «антиген–антитело–комплемент» в том случае, если в исследуемой сыворотке крови пациента присутствуют антитела к антигену диагностикума. При отсутствии антител комплемент остается свободным и иммунные комплексы «антиген–антитело–комплемент» не образуются. Внешне образование иммунных комплексов не проявляется никакими феноменами вследствие особенностей взаимодействия антиген–антитело. Для индикации образования иммунных комплексов и для регистрации результатов РСК после инкубации в диагностическую систему добавляют индикационную систему. Индикаторная система представляет собой суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами к ним же. Объединение двух систем и инкубация их при определенном режиме с последующим центрифугированием позволяет зарегистрировать результаты РСК по феномену задержки гемолиза. Механизм индикации результатов РСК следующий: 1) антитела к диагностикуму в исследуемой сыворотке крови отсутствуют. РСК отрицательна. В данной ситуации во время инкубации компонентов 1-й (диагностической) системы не происходит образования иммунных комплексов. Комплемент находится в свободном состоянии. Добавление индикаторной системы (суспензии сенсибилизированных антителами эритроцитов барана) активирует имеющийся комплемент по классическому пути с последующей сборкой мембраноатакующего комплекса на поверхности эритроцитов. В результате эритроциты барана лизируются. Таким образом, отрицательная РСК сопровождается полным гемолизом: после центрифугирования на дне пробирок осадка нет, а все содержимое представляет собой прозрачный красно-оранжевый раствор; 2) антитела к диагностикуму в исследуемой сыворотке крови присутствуют, значит РСК положительна. В данной ситуации во время инкубации компонентов 1-й (диагностической) системы образуются иммунные комплексы. Комплемент находится в связанном с этими комплексами виде. Последующее добавление индикаторной системы не вызывает гемолиза, так как свободный комплемент отсутствует. Учет результатов РСК проводится по системе 4+: – РСК – сопровождается полным гемолизом, изложенном выше, ++++ РСК соответствует 100 %-му связыванию антигена антителами и образованию комплексов «антиген–антитело–комплемент». После центрифугирования в пробирке образуется осадок эритроцитов, супернатант прозрачный, бесцветный; +++ РСК соответствует 75 %-му связыванию антигена антителами, а значит определенная часть комплемента остается в свободном виде и активируется гемолитической системой. После центрифугирования на дне пробирки виден осадок эритроцитов, супернатант имеет слегка желтоватую окраску из-за лизиса части эритроцитов; ++ РСК соответствует 50 %-му связыванию антигена антителами, а значит практически половина комплемента находится в свободном виде и вызывает гемолиз практически половины эритроцитов индикаторной системы. После центрифугирования в пробирке на дне виден осадок эритроцитов менее значительный, чем при +++ и ++++ РСК, а супернатант окрашен в красно-оранжевый цвет; + РСК – сомнительный результат, после центрифугирования на дне имеется незначительный осадок эритроцитов, а супернатант окрашен как и при отрицательной РСК. |