Серологические методы диагностики. Серологические методы диагностики текст. Слайд 1 Серологические методы диагностики заболеваний. Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний основана на выявлении антител в организме пациента к возбудителю инфекции методами серологических исследований.
 Скачать 290.51 Kb.
|
|
СЛАЙД 16 Иммунохимический анализ (ИХА) представляет собой группу родственных методов, отличительной особенностью которых является определение количества анализируемого вещества (АГ или АТ) по количеству комплексов, которые формируются при взаимодействии данного вещества с неким связывающим агентом, имеющим определенную визуализирующую метку. В зависимости от данной метки выделяют следующие методы иммунохимического анализа: радиоизотопный (в качестве метки используются изотопы), иммуноферментный (ферменты), иммунофлуоресцентный (флуорохромы). Иммуноферментный метод (иммуноферментный анализ, ИФА) – метод определения АГ или АТ, основанный на определении комплекса АГ–АТ и использовании ферментативной метки. В качестве фермента применяют чаще всего пероксидазу хрена, реже – -глюкуронидазу, щелочную и кислотную фосфатазу и т. д. Выделяют несколько вариантов ИФА: непрямой метод используется для обнаружения АТ, метод «двойных» антител («сэндвич»-метод) – АГ. Кроме того, иммуноферментные тест-системы могут быть количественными и качественными. Последние используется только в целях скрининга наличия/отсутствия искомого АТ или АГ в биологических образцах. Учет результатов количественного ИФА проводится с помощью спектрофотометрического измерения оптической плотности окрашенных продуктов, которые образуются в результате ферментативного расщепления субстрата ферментом. В данном случае имеется стандартный образец, содержащий АГ или АТ в известной концентрации и используемый для построения калибровочного графика. Впоследствии на данном графике откладывается оптическая плотность исследуемого биологического образца и определяется концентрация АГ/АТ в нем. Преимуществами ИФА являются высокая специфичность и чувствительность, высокий уровень автоматизации благодаря наличию специальных анализаторов и стандартных тест-систем, широкое использование в клинических и научно-исследовательских целях. В настоящее время выпускаются тест-системы для определения антител к разным микроорганизмам. Имеются иммуноферментные тест-системы для выявления антител разных классов, анализ наличия которых позволяет эффективно определять фазу и стадию инфекционного заболевания, а также отличать анамнестическое наличие антител к возбудителю инфекции и поствакцинальные реакции от инфекционного заболевания. В диагностике инфекционных заболеваний зачастую нужно поставить диагноз в максимально короткие сроки. Для этого разработаны специальные методы экспресс-диагностики. Их отличает скрининговый характер, простота постановки и регистрации результатов, отсутствие специального оборудования для постановки. Большинство реакций экспресс-диагностики позволяют сделать качественное, а не количественное определение самого возбудителя. Методы экспресс-диагностики применяются в отношении самых разных патогенов, включая ВИЧ, вирусы гепатитов, хламидии, возбудитель сифилиса и др. СЛАЙД 17 РИФ, реакция иммунофлюоресценции – метод выявления специфических АГ или АТ с помощью АТ (АГ), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и маркёров иммунокомпетентных (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямая РИФ состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной культуры специфическими АТ, конъюгированные с флюорохромом. Препарат промывают для освобождения от несвязанных АТ и исследуют в люминесцентном микроскопе. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Для исключения неспецифического свечения используются специальные положительные и отрицательные контроли. При непрямой РИФ на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующими специфическими антителами, на втором – люминесцирующими антителами к -глобулинам того животного, сыворотка которого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из АГ, АТ к нему и АТ против АТ («сэндвич»-метод). СЛАЙД 18 Иммунохроматографический метод основан на ИФА, но все диагностические компоненты сорбированы на специальном носителе. Исследуемый материал (в объеме порядка 10 мкл) помещается на один из концов этого носителя и всасывается в него. При соответствии антител исследуемого материала и диагностических компонентов (антигенов возбудителя) происходит их связывание, проявляющееся окрашиванием полоски носителя. В настоящее время данный метод применяется в качестве экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а также для определения ряда гормонов. СЛАЙД 19 Сущность реакции состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие этого происходит лизис этих клеток. Эта реакция используется при типировании антигенов системы HLA на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLA-антигенов, затем их отмывают и добавляют комплемент. Присутствие соответствующего антигена приводит к лизису лимфоцитов. СЛАЙД 20 Вариант ИФА, повышающий чувствительность метода при изучении гетерогенной смеси антигенов. Смесь антигенов подвергают дискэлектрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Полученные таким образом индивидуальные полосы антигенов переносят на нитроцеллюлозные полоски с помощью специального аппарата для переноса. В дальнейшем ход реакции сводится к гетерогенному не конкретному ИФА. Нитроцеллюлозные полоски с перенесенными на них антигенами обрабатывают испытуемой сывороткой. Имеющиеся в ней антитела связываются с индивидуальными антигенами, представленными в виде отдельных полос. Связавшиеся антитела проявляют при обработке конъюгатом фермента с антителами к иммуноглобулинам человека. На последнем этапе определяют активность фермента. Таким образом, можно определить против каких антигенов смеси направлены антитела сыворотки больного. На основе реакции иммуноблотинга созданы диагностические наборы для определения в сыворотке больного антител к вирусу гепатита С и ВИЧ-1-2. СЛАЙД 21 Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса антиген-антитело, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (I-125 и I-131). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков ионизирующего излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая не безопасность работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании. СЛАЙД 22 Серологическая диагностика бактериальных инфекций. Диагностика инфекций, вызываемых стрептококками A,B,C,D,F,G. На основании антигенных различий большая часть стрептококков, выделенных от человека, относятся к группам A,B,C,D,F,G. Стрептококки группы А имеют исключительно важное значение, поскольку часто вызывают инфекционные заболевания у человека и играют существенную роль в развитии ревматизма и гломерулонефрита. Стрептококки группы В часто гнездятся в женских половых путях и на слизистых оболочках глотки и прямой кишки. Стрептококки групп С и G представляют собой комменсалы, но они способны вызывать фарингиты. Стрептококки группы D часто служат причиной инфекции мочевых путей у больных с их структурными аномалиями и более чем в 10% случаев относятся к этиологическим факторам при бактериальном эндокардите. Серологическая диагностика направлена на выявление титра антител в сыворотке больного. Диагностическим считается нарастание титра антител через 10-14 суток не менее чем в 4 раза при исследовании парных сывороток. Однократное исследование диагностического значения не имеет, так как практически у 100% взрослых в сыворотке определяются антитела к стрептококкам. Маркер острой стрептококковой инфекции - антитела против стрептококкового гемолизина-О (АСЛО). Уровень повышается в острый период инфекции (7-14 день) и снижается в период реконвалесценции и выздоровления. В клинической практике используется для наблюдения за динамикой ревматического процесса. Титр АСЛО повышается у 80-85% больных с ревматической лихорадкой. Диагностическое значение имеет стойкое значительное повышение активности АСЛО. К 3-й неделе заболевания ревматизмом титр значительно повышается, достигая максимума к 6-7 неделе. При благоприятном течении процесса к 4-8 месяцу активность АСЛО снижается до нормы. Под влиянием проводимой терапии эти сроки могут сократиться. Отсутствие снижения активности антистрептолизина-О к 6 месяцу заболевания позволяет предположить возможность рецидива. Стойкое и длительное повышение активности после ангины может быть предвестником ревматического процесса. В 10-15% случаев ревматизма повышения активности АСЛО не определяется. Повышение АСЛО находят у некоторых больных с ревматоидным артритом, однако уровень повышения АСЛО при этом заболевании ниже, чем при ревматизме. При выделении b-гемолитических стрептококков группы А повышенные титры АСЛО выявляются у 40-50% бактерионосителей. Повышение уровня АСЛО характерно для: ревматизма, острой стрептококковой инфекции: ангины, скарлатины, пиодермии, гнойных воспалительных процессов, хронического тонзиллита, острого нефрита, гломерулонефрита. Диагностика инфекций, вызываемых стафилококками. Серологическая диагностика направлена на выявление титра антител в сыворотке больного. Диагностическим считается нарастание титра антител через 7-10 суток при исследовании парных сывороток. Однократное исследование диагностического значения не имеет, так как практически у 100% взрослых в сыворотке определяются антитела к стафилококкам. Диагностика инфекций, вызываемых пневмококками. Серологическая диагностика направлена на выявление титра антикапсулярных антител в сыворотке больного. Диагностическим считается нарастание титра антител через 7-10 суток при исследовании парных сывороток. Диагностика инфекций, вызываемых гемофильной палочкой. Для диагностики исследуются кровь, моча, жидкость из плевры, суставов, спинномозговая жидкость и др. Определение антител к гемофильной палочке в сыворотке является ретроспективным методом диагностики заболевания, так как необходимо исследовать сыворотку в первую неделю заболевания и через 10-14 суток. Диагностическим считается нарастание титра антител через 10-14 суток не менее чем в 4 раза при исследовании парных сывороток. Диагностика менингококковой инфекции. Возбудителем менингококковой инфекции является грамотрицательный диплококк Neisseria meningitis. Выделяют 5 серологических типов менингококка - A,B,C,D,E. В период эпидемий преобладает тип А, во внеэпидемический период - тип В. Культивирование менигококков и выделение их в чистой культуре удается лишь у 30-40% больных. В связи с этим для диагностики используются серологические методы, наиболее чувствительны и информативны из них - РНГА и иммуноферментный методы. Исследуется сыворотка крови больного на 1-3 день от начала заболевания и на 7-10 день. Диагностическим считается нарастание титра антител через 7-10 суток не менее чем в 4 раза. Диагностика бруцеллеза. Возбудитель бруцеллеза - бруцеллы - мелкие неподвижные грамотрицательные бактерии. При постановке диагноза бруцеллеза полученные клинико- эпидемиологические данные должны быть подтверждены лабораторно. С этой целью используются бактериологический, биологический и серологический методы исследования. Реакция Хеддельсона на стекле используется для полуколичественного определения антител к возбудителю бруцеллеза и является ориентировочным тестом. Самым надежным серологическим тестом определения антител к возбудителю бруцеллеза в сыворотке является реакция агглютинации Райта, посредством которой определяют уровень антител, реагирующих, главным образом, с липополисахаридными антигенами бруцелл. Увеличение титров антител в 4 и более раз в пробах сыворотки крови, полученных с интервалом 1-4 недели, позволяет идентифицировать этиологический фактор заболевания. У большинства больных повышение титров специфических антител отмечается на 3-5-й день от начала заболевания, а на 3-й неделе фактически у всех происходит сероконверсия. Достоверным считается титр антител не менее 1:200 с последующим его нарастанием. Причиной ложноположительных результатов может служить проведение кожной пробы на бруцеллез, вакцинация против холеры, а также инфекции, вызванные холерным вибрионом, иерсиниями. Агглютинирующие антитела IgG можно определить в реакции агглютинации путем экстрагирования с 2-меркаптоэтанолом. Антитела IgG появляются на 2-3-й неделе от начала заболевания, титры их достигают максимума примерно через 8 недель и сохраняются весь период активной инфекции, благодаря чему они свидетельствуют о продолжающемся активном инфекционном процессе. На фоне проводимого лечения титры антител IgG быстро снижаются и в течение года приближаются к нулю. В случае рецидивов уровень антител IgG снова повышается. Наличие однократного повышения титра антител IgG > 1 : 160 является надежным объективным указанием на текущую или недавно имевшую место инфекцию и необходимость проведения лечения. После проведенного лечения и выписки больного из стационара рекомендуется проведение серологических исследований в течение первого года через 1,2,3,6,9,12 месяцев, а в течение второго года - ежеквартально. Диагностика сальмонелезной инфекции. Описано более 2200 серологических вариантов сальмонелл, из них у человека более 700. Наиболее часто встречаются следующие сальмонеллы: S.typhimurium, S.heidelberg, S.enteritidis, S.anatum, S.derby, S.london, S.panama, S.newport. Ежегодно 20-35% изолятов приходится на S.typhimurium (Пак С.Г. с соавт., 1988). Антигенная структура сальмонелл сложна. Она содержит О- и Н-антигены. О-антиген связан с соматической субстанцией клетки, термостабилен, одним из его компонентов является Vi-антиген; Н-антиген обладает жгутиковым аппаратом, термолабилен. Различия в строении О-антигенов позволили выделить серологические группы сальмонелл: А,В,С,D,Е и др. На основании различий в строении Н-антигенов внутри каждой группы установлены серологические варианты. В лабораторной диагностике сальмонеллезной инфекции испольуются бактериологические и серологические методы диагностики. Среди серологических методов диагностики до последнего времени широко применялась реакция Видаля, которая в последние годы постепенно утрачивает свое значение. В настоящее время для выявления антител к сальмонеллам наиболее широко используются РПГА и иммуноферментный метод, которые более чувствительны и дают положительные результаты с 5-го дня заболевания (реакция Видаля на 7-8 день). Антитела у больных брюшным тифом, паратифом или другими серологическими типами сальмонелл появляются в крови уже к 4-му дню болезни и резко нарастают к 8-10-му дню. Количество их еще более увеличивается на 2-3-й неделе заболевания (Пак С.Г. с соавт., 1988). В первые месяцы после выздоровления исследование на антитела к сальмонеллам может служить и для целей ретроспективного диагноза. Необходимо, однако, учитывать индивидуальные отклонения от нормального цикла иммуногенеза и изложенной динамики изменения титра антител. В ослабленном организме со сниженной реактивностью слабо и медленно вырабатываются антитела. Интеркурентные заболевания также могут задержать их формирование. Таким образом, титр антител менее 1:200 не позволяет исключить заболевание, поэтому чрезвычайно важно исследовать титр антител в динамике в начале заболевания и через 10-14 суток. Нарастание титра антител через 10- 14 суток не менее чем в 4 раза при исследовании парных сывороток свидетельствует об инфекционном процессе. На основании антигенной структуры, присущей различным видам сальмонелл, разработаны О- и Н-монодиагностикумы, которые позволяют установить серологический вариант сальмонелл. Первоначально исследуется сыворотка в РПГА с комплексным препаратом диагностикума эритроцитарного сальмонелезного-О. Далее, при наличии агглютинации с комплексным диагностикумом, РПГА ставят с препаратами групп А (1,2,12), В (1,4,12), С1 (6,7), С2 (6,8), Д (1,9,12) и Е (3,10). В таблице представлена антигенная характеристика сальмонелл, на основании которой и осуществляется диагностика серологических вариантов сальмонелл. Антигенная характеристика сальмонел. Группа. Сальмонеллы. Антигены. Соматические - О. Жгутиковые - Н специфические. А S.paratiphi A 1, 2, 12 a B S. paratiphi B 1, 4, 5, 12 b S.typhimurium 1, 4, 5, 12 i S.heidelberg 4, 5, 12 r S.derby 1, 4, 12 f,g C1 S.paratiphi C 6, 7, Vi c S.choleraesuis 6, 7, c S.newport 6, 8 e, h D1 S.typhi 9, 12, Vi d S.enteritidis 1, 9, 12 g, m E1 S.anatum 3, 10 e, h S.london 3, 10 l, v Vi-антителам в инфекционном процессе не придают диагностического и прогностического значения. Иначе обстоит дело с выявлением Vi-антител у бактерионосителей. Большая резистентность содержащих Vi-антиген носителей к защитным механизмам человека обуславливает более длительное носительство этих форм (Vi-форм) тифозных палочек, вследствие чего в крови носителей обнаруживаются Vi- антитела. Vi-антитела являются прямым доказательством носительства брюшнотифозных бактерий. Диагностика туберкулеза. Возбудитель туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis. Микобактерии очень медленно растут на питательных средах, и для получения даже предварительного ответа при бактериологическом исследовании требуются 3 недели, что очень не устраивает клиницистов. В таких случаях до получения ответа результатов бактериологического исследования используют серологические методы диагностики и метод цепной полимеразной реакции. Определение антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке является новым и очень перспективным методом серологической диагностики туберкулеза. Применяемый в настоящее время бактериологический метод выделения микобактерий туберкулеза, требует значительных временных затрат (от 4 до 8 недель) и весьма эффективен, в основном, при легочных формах туберкулеза. Использование серологических методов диагностики, в частности иммуноферментного метода, позволяет значительно сократить время лабораторного подтверждения клинического диагноза, активно применять его для диагностики внелегочных форм туберкулеза, и особенно ценен он для диагностики туберкулеза у детей (трудности со сбором мокроты, множественные рентгенологические исследования). Диагностическим считается нарастание титра антител через 10-14 суток не менее чем в 4 раза. |