вопросы к семинару 1. Вопросы к семинару №1. Вопросы охарактеризуйте структурные компоненты нуклеиновых кислот
 Скачать 1.32 Mb.
|
|
ВОПРОСЫ 1. Охарактеризуйте структурные компоненты нуклеиновых кислот. В состав НК входят остатки азотистого основания, пентозы и фосфорной кислоты. Среди азотистых оснований выделяют пиримидиновые и пуриновые основания, которые называют также пиримидины и пурины. К пиримидинам относятся:  2. Из каких компонентов состоят нуклеозиды, как формируются их названия? Как называют нуклеозиды РНК и ДНК?  Названия нуклеозидов строят на основе тривиальных названий нуклеиновых оснований, добавляя окончание –идин для производных пиримидина и -озин для производных пурина. К названиям дезоксирибонуклеозидов добавляют приставку дезокси. Исключение составляет нуклеозид, образованный тимином и дезоксирибозой, к которому приставка дезокси- не добавляется, так как тимин образует нуклеозиды с рибозой лишь в очень редких случаях. 3. Что такое нуклеотиды, как формируются их названия? Как называют нуклеотиды РНК и ДНК?  В зависимости от строения пентозы различают рибонуклеотиды (мономерные звенья РНК) и дезоксирибинуклеотиды (мономерные звенья ДНК).Связь между углеводным остатком и гетероциклических соединением в нуклеотиде обеспечивается посредством N-гликозидной связи. Аналогично АМФ и дАМФ образуются названия и других нуклеотидов: гуанозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, цитидинмонофосфат, дезоксицитидинмонофосфат, уридинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат К нуклеозидмонофосфатам и дезоксинуклеозидмонофосфатам могут присоединиться еще 1 или 2 остатка фосфорной кислоты, в результате образуются нуклеозиддифосфаты (НДФ) и дезоксинуклеозиддифосфаты (дНДФ), нуклеозидтрифосфаты (НТФ) и дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ):  НТФ и дНТФ служат субстратами для синтеза РНК и ДНК, соответственно.Названия нуклеотидов включают название нуклеозида с указанием положения в нем остатка фосфорной кислоты. Сокращенные обзначения нуклеозидов содержат обозначение нуклеозида, остатка моно-, ди- или трифосфорной кислоты, для 3/-производных указывается также положение фосфатной группы. 4. Охарактеризуйте первичную структуру нуклеиновых кислот. Определение нуклеотидной последовательности. Под первичной структурой нуклеиновых кислот понимают порядок чередования нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Мономерные остатки в нуклеиновых кислотах связаны между собой фосфодиэфирными связями, которые осуществляются только за счет 3' – ОН одного нуклеотидного остатка и 5' – ОН другого. Эта меж нуклеотидная связь называется 3',5'-фосфодиэфирной. Поэтому полинуклеотидные цепи ДНК и РНК полярны и их концевые остатки неравноценны: если рассматривать нефосфолирированный по концам нуклеотид, то на одном конце он будет содержать 3' – ОН, а на другом 5' – ОН. Эти концы называют 3' и 5' – концами цепи соответственно. Из-за наличия 2' – ОН группы у рибозы межнуклеотидные связи в РНК значительно мобильнее, чем в ДНК и легко гидролизуются в присутствие щелочи.  Определение нуклеотидной последовательности ДНК и РНК Исходную молекулу фрагментов ДНК предварительно фрагментируют с помощью рестриктаз, причем осуществляют независимое расщепление двумя и более рестриктазами, в результате чего образуются перекрывающиеся фрагменты, что позволяет после определения нуклеотидной последовательности соответствующих фрагментов реконструировать первичную структуру всей ДНК. Используют два подхода к определению первичной структуры ДНК. Способ 1. Предложен А. Максамом и У. Гилбертом и основан на специфическом химическом расщеплении непосредственно фрагментов очищенной полинуклеотидной цепи. Способ 2. Предложен Ф. Сенгером и сотр. В его основе лежит копирование анализируемого участка ДНК с помощью ДНК-полимеразной реакции. При секвенировании вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками, что позволяет сканирование гелей при разных длинах волн и передавать данные непосредственно на компьютер. 5. Дайте определение понятию «Конформация молекулы». Охарактеризуйте конформации компонентов нуклеиновых кислот. Конформации молекулы – это различные пространственные формы, принимаемые молекулами в результате свободного вращения отдельных фрагментов вокруг простых связей, изгиба связей, происходящие при сохранении неизменными порядка химической связи атомов (химического строения), длины связей и валентных углов, т. е. конформацией молекулы называется такое распределение, которое может непрерывным или дискретным образом меняться без химических реакций. Все пять гетероциклических оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот, имеют плоскую конфигурацию. Однако, для остатков рибозы и дезоксирибозы плоская конформация (т.е. атомы углерода С1', С2', С3', С4', и гетероатом кислорода находятся в одной плоскости) энергетически не выгодна. Среди многочисленных теоретически возможных конформаций этих остатков полинуклеотидах реализуются только две: С2'-эндо- и С3'-эндоконформациинуклеотидная единица с 3'-эндоконформацией углеводного остатка имеет меньшую длину, чем 2'-эндоизомер.  Основной характеристикой в определении конформации нуклеотидного звена является взаимное расположение углеводной и гетероциклических частей, которое определяется углом вращения вокруг N-гликозидной связи. Исследования показали, что существуют две области разрешенных конформаций, называемых син- и анти-конформациями. Для пиримидиновых нуклеотидов, как правило характерна анти-конформация относительно глюкозидной связи с С3' эндоконформацией рибозы и С2' эндоконформацией дезоксирибозы.В случае пуриновых нуклеотидов анти- и син-конформация встречаются одинаково часто, если сахар пребывает в С2' эндоконформацией. В случае С3' эндоконформации равновесие сдвигается в сторону анти-конформации. В свободных нуклеизидах и нуклеотидах переход от С2'-эндо- и С3'-эндо- и между син- и анти-конформациями происходит достаточно свободно. Но если, нуклеотидный остаток встроен в полинуклетидную цепь, то его конформация при данных внешних условиях остается фиксированной. В обычных формах полинуклеотидов мономерные звенья имеют исключительно анти-конформацию. Следует отметить, в полидезоксирибонуклеотидах углерод может быть как в 2'-эндо- и 3'-эндоконформации, тогда как в полирибонуклеотидах углерод чаще находится в 3'-эндоконформации. 6. Макромолекулярная структура ДНК. Типы взаимодействий между гетероциклическими основаниями нуклеотидных остатков. Правило Чаргаффа. Макромолекулярная структура ДНК Пространственная организация макромолекул ДНК и РНК задается их нуклеотидной последовательностью и описывается структурами двух уровней: вторичной и третичной. Вторичная структура создается за счет взаимодействия соседних по полинуклеотидной цепи мономерных звеньев, а в случае двух спиральных молекул также взаимодействием нуклеотидных остатков, находящихся напротив друг друга в двойной спирали. Третичная структура нуклеиновых кислот организуется за счет взаимодействия нуклеотидных остатков, принадлежащих различным элементам их вторичной структуры. Двойная спираль ДНК. Модель Уотсона-Крика была предложена в 1953 г согласно которой молекула ДНК представляет собой: 1) ДНК состоит из двух цепей, закрученных в правую двойную спираль; 2) цепи в молекуле ДНК расположены относительно друг друга антипараллельно; 3) молекулы азотистых оснований ориентированы перпендикулярно оси двойной спирали; 4) на внешней стороне двойной спирали находятся остатки пентозы и фосфорной кислоты; 5) цепи ДНК при закручивании в двойную спираль образуют большую и малую борозды, ширина большой борозды – 2,2 нм, малой – 1,2 нм; 6) на один виток спирали приходится 10 нуклеотидных остатков; 7) полный виток спирали имеет длину 3,4 нм; 8) диаметр двойной спирали 1,8 нм; 9) цепи ДНК связаны друг с другом водородными связями, которые образуются между гуанином одной цепи и цитозином другой цепи, или между тимином и аденином, расположенными в разных цепях; 10) между тимином и аденином образуются две водородные связи, а между гуанином и цитозином – три водородные связи войная спираль стабилизируется с помощью водородных связей между пуринами одной цепи ДНК и пиримидинами другой. Основания, образующие пары, в которых они сочетаются водородными связями получили название комплементарных пар. В А-Т паре основания соединены двумя водородными связями: одна – между амино- и кетогруппами, другая – между двумя атомами азота пурина и пиримидина соответственно. В G-C паре имеются три водородные связи: две из них образуются между амино- и кетогруппами соответствующих оснований, а третья – между атомами азота пурина и пиримидина. Макромолекулярная структура ДНК определяется двумя типами взаимодействий между гетероциклическими основаниями нуклеотидных остатков: Взаимодействие между основаниями в комплементарных парах. Образование комплементарных пар оснований постулировано Уотсоном-Криком. Обе пары близки по форме и имеют одинаковые размеры. Кроме уотсон-криковских пар гетероциклические основания способны образовывать множество связанных водородными связями пар другой структуры. Однако, доказано, что именно уотсон-криковские пары наиболее энергетически выгодны. В этих парах центры с повышенной и пониженной электронной плотностью оснований расположены оптимально друг относительно друга, такой вид комплиментарности называют электронной. Вертикальные межплоскостные взаимодействия оснований, расположенными друг над другом (стэкинг-взаимодествие). Поскольку гетероциклические основания достаточно гидрофобны, в водном растворе им оптимальнее располагаться друг над другом, уменьшая тем самым контакт с водой. Этот вид взаимодействия обусловлен в основном ван-дер-ваальсовыми силами и зависят от состава комплиментарных пар и от их последовательности. На существование этих взаимодействий в растворахполинуктиотидов оказывает влияние отклонение от физико-химических характеристик. 6. Полиморфизм двойной спирали. Назовите особенности строения и функции ДНК разных семейств. Полиморфизм двойной спирали В настоящее время установлено, что существует несколько форм двойной спирали ДНК. Правые спирали образуют два семейства: А-семейство (конформация сахара С3'-эндо); В-семейство (конформация сахара С2'-эндо). В зависимости от условий (концентрации соли, температуры) структуры в пределах каждого из семейств могут иметь: разной число пар, приходящихся на виток спирали, разный наклон пар оснований к оси спирали и т.д. А-семейство ДНК. С3'-эндоконформация сахара способствует уменьшению расстояния между фосфатными группами и нуклеотидными парами вдоль оси спирали. Это приводит к увеличению количества нуклеотидов на виток спирали (11). При этом пары оснований образуют с осью спирали угол около 20º и очень сильно отодвитуты от оси спирали к периферии молекулы на 0,4 – 0,5 нм, т.е. почти половину радиуса. Поэтому А-ДНК при взгляде сверху выглядит как труба. В А-ДНК в стэкинге участвуют основания, принадлежащие разным цепям, т.е. имеет место как одно-, так и двуцепочечный стэкинг. Это обусловлено величиной угла наклона плоскостей оснований к оси спирали и углом поворота оснований относительно оси спирали. В биологическом плане А-форма ДНК участвует в транскрипции и передачи информации от ДНК к РНК. В-семейство ДНК. Для данного семейства характерно структурное разнообразие ДНК, установлено, что описанная модель Уотсона-Крика является одной из В-форм ДНК. ДНК со случайными последовательностями могут находиться в В-, С-, D- и других конформационных состояниях. На структуру ДНК влияют тип и концентрация катионов и температура. В биологическом плане В-форма ДНК участвует в репликативных процессах, в умножении количества информации, С-форма ДНК наиболее оптимальна для упаковки ДНК в составе надмолекулярных структур хроматина, т.е. в хранении информации. Z-форма ДНК левая спираль, в которую переходит двойная спираль В-типа ДНК при высокой концентрации солей или добавлении спирта. Особенностью Z-ДНК является чередование син- и анти-конформаций нуклеотидных остатков: дезоксицитидин имеет стандартную конформацию, т.е. сахар С2'-эндо-, основание – анти- у дезоксигуанозина сахар находится в С3'-эндо, а основание имеет син-конформацию.Стэкинг оснований отмечается между остатками цитозина противоположных цепей, а остатки гуанина вообще не взаимодействуют друг с другом, контактируя с атомами соседних дезоксицитидинов. Z-ДНК обнаружена в междисковых областях политенных хромосом (гигантские интерфазные хромосомы, возникающие в некоторых типах специализированных клеток в результате двух процессов: во-первых, многократной репликации ДНК, не сопровождаемой делением клетки, во-вторых, боковой конъюгации хроматид. Клетки, в которых есть политенные хромосомы, теряют способность к делению, они являются дифференцированными и активно секретирующими, то есть, политенизация хромосом является способом увеличения числа копий генов для синтеза какого-либо продукта). Возможно, Z-форма выполняет какую-то регуляторную функцию. 7. Сверхспирализация ДНК. Топоизомеразы. Сверхспирализация ДНК. Топоизомеразы Сверхспирализация ДНК – это явление пере- или недокручивания топологически замкнутых цепей ДНК, при котором ось двойной спирали ДНК сама закручивается в спираль более высокого порядка. Сверхспирализация ДНК может быть: положительной, т.е. ось двойной спирали закручена в том же направлении, что и цепи двойной спирали (почасовой стрелки); отрицательной, т.е. ось двойной спирали закручена против часовой стрелки (характерно для большинства мезофильных организмов). ДНК – топоизомеразы – это ферменты, изменяющие типологию ДНК, релаксируя сверхспирализованные молекулы ДНК и снимая их внутреннее напряжение путем внесения одноцепочечных и двуцепочечных разрывов с последующим их восстановлением. Для внесения одноцепочечного разрыва в ДНК все ДНК – топоизомеразы используют остаток тирозина, осуществляющий нуклеофильную атаку фосфатной группы ДНК с образованием фосфотирозина. В результате ферменты оказываются ковалентно связанными с 5 и 3 концами ДНК в одноцепочном разрыве. По механизму действия ДНК – топоизомеразы подразделяются на 2 типа: 1. ДНК – топоизомеразы I типа – мономерные белки, релаксирующие ДНК без затраты энергии путем внесения одноцепочечных разрывов. Выделяют 2 подтипа: Тороизомеразы подтипа I - 5' связываются преимущественно с одноцепочными участками ДНК, осуществляя разрыв с образованием 5'-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центра фермента. Ферменты этого типа снимают только отрицательную суперспиралицацию. Характерны для прокариот. Тороизомеразы подтипа I - 3' связываются с двуцепочной ДНК, разрывают одну цепь с образованием 3'-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центра фермента. Через разрыв проходит вторая цепь дуплекса, уменьшая плотность спирализации ДНК, знак спирализации значения не имеет. Характерны для эукариот. 2. ДНК – топоизомеразы II типа – функционируют в виде димеров (у эукариот) и тетромеров (у прокариот), осуществляя АТФ-зависимое расщепление обеих цепей ДНК с последующим переносом цепей через разрыв и его лигированием. Топоизомераза связывается с двуцепочечной ДНК и осуществляет разрыв обеих цепей с образованием двух 5'-фосфодиэфирной связи с тирозинами активного центра. в образовавшуюся щель проходит вторая вдухцепочечная ДНК, результатом является изменение числа положительных или отрицательных супервитков на 2. 8. Общая характеристика и функции РНК. Структура и функции РНК Содержание РНК в любых клетках в 5-10 раз превышает содержание ДНК. Основная роль РНК состоит в трансляции генетической информации с образованием белков, а также в осуществлении специализированных эндонуклеазных функций, регулирующих различные этапы экспресии генов. Во всех клетках присутствуют следующие виды РНК: Рибосомная р-РНК (80-85%); Транспортная т-РНК (около 10%); Информационная (матричная) м-РНК (менее 5%); Цитоплазмические мц-РНК менее 1%; Малые ядерные мя-РНК (в клетках эукариот) менее 1%. Макромолекулярная структура РНК представлена: Двутяжевые РНК построены из двух комплементарных полинуклеотидных цепей, характерны только для некоторых вирусов. Однотяжевые РНК построены из одной полирибонуклеотидной цепи. Вторичная структура РНК. Основной элемент вторичной структуры – короткие двойные спирали, образованные комплементарными участками одной и той же цепи и чередующиеся с ее однотяжевыми сегментами. Полинуклеотидные цепи в этих двуспиральных структурах антипараллельны, а сами спирали находятся в А-форме и имеют дефекты в виде неспаренных нуклеотидных остатков или однотяжевых петель. В однотяжевых участках наблюдаются сильные стэкинг-взаимодействия оснований, вследствие чего они стремятся принять конформацию однотяжевой спирали. Третичная структура РНК возникает за счет взаимодействия элементов их вторичной структуры: Элементы вторичной структуры расположены относительно друг друга таким образом, чтобы обеспечить максимальный стэкинг оснований в макромолекуле Контакты осуществляются за счет следующих взаимодействий: образование дополнительных пар оснований между нуклеотидными остатками удаленных друг от друга однотяжевых участков и триплетов оснований между нуклеотидными остатками однотяжевых и двутяжевых элементов; дополнительные стэкинг-взаимодействия после внедрения (интеркаляции) оснований одного участка между двумя соседними основаниями другого однотяжевого участка; образование дополнительных водородных связей между 2'ОН-группами остатков рибозы и основаниями, а также другими группами пентозофосфатного остова. 3. Третичная структура РНК стабилизирована ионами двухвалентных металлов, которые связываются не только с фосфатными группами, но и с основаниями. 9. Охарактеризуйте особенности строения и функции т-РНК. Транспортные РНК (т-РНК) осуществляют: а) трансформация генетической информации, закодированной в и-РНК, в информацию о первичной структуре белка; б) перенос аминокислотных остатков к месту синтеза белка. На долю т-РНК приходится около 10 – 15 % общего количества клеточной РНК. Последовательность т-РНК состоит из 70 – 90 нуклеотидов, в которой имеются модифицированные (минорные) азотистые основания (псевдоуридин, дигидроуридин, тимидин, 7-метилгуанозин, инозин и др.). Их доля может достигат до 25 %. На 3’-конце всех т-РНК находится тринуклеотидная последовательность ЦЦА. Более половины оснований т-РНК образуют внутрицепочечные пары по принципу комплементарности, в целом формируется вторичная структура в виде клеверного листа, состоящего из 4-5 двух цепочечных спиральных стеблей и трех петель. Каждый стебель содержит 4-7 уотсон-криковских пар, образующих двойные спирали. Различают: а) дигидроуридиловую ветвь, содержащую до 3 остатков дигидроуридина; б) псевдоуридиловую ветвь, содержащую минорные азотистые основания псевдоуридина; в) антикодоновую ветвь, в центре которой находится антикодон, который комплементарен в антипаралельном направлении кодону и-РНК; антикодон имеет жесткую архитектуру, которая позволяет ему быстро считывать матричную РНК. г) дополнительную ветвь. Число составляющих ее нуклеотидов варьирует от 3 до 20. В некоторых т-РНК данная ветвь отсутствует; д) акцепторную ветвь с универсальной 3'-концевой последовательностью ЦЦА, служащей акцептором остатка аминокислоты, который присоединяется к 3’- или 2’-гироксильной группе остатка рибозы последнего нуклеотида. Число нуклеотидов в стеблях и петлях почти постоянно у разных видов т-РНК за исключением вариабельных петель. Наиболее детально отработана третичная структура дрожжевой т-РНК. В последовательности т-РНК имеются инвариантные основания, т.е. основания, присутствующие во всех т-РНК. «Третичные» взаимодействия включают: стэкинг, интеркаляцию – обратимое включение молекулы или группы между другими молекулами или группами, необычное спаривание оснований, при котором образуются пары и триплеты. Все т-РНК имеют сходную пространственную структуру, напоминающую латинскую букву L. 10. Охарактеризуйте особенности строения и-РНК прокариот. и-РНК прокариот – это короткоживущие молекулы, их время полужизни составляет всего около 2 мин. Большая часть генома прокариот кодирует и-РНК, так у E.coli информацию о первичной структуре и-РНК хранит 90 – 95 % хромосомы. и-РНК прокариот в большинстве случаев являются полицистронными, и только некоторые из них – моноцистронными. Полицистронные и-РНК содержат нетранслируемые межцистронные области, которые разделяют участки, кодирующие полипептидные цепи (цистроны). Со стороны 5’-конца и-РНК располагается лидерная некодирующая последовательность, содержащая в своем составе последовательность Шайна-Дальгарно, которая комплементарна 16S р-РНК и определяет правильную ориентацию и-РНК на рибосоме в процессе трансляции. Со стороны 3’-конца располагается некодирующая концевая последовательность (трейлер). Кодирующие последовательности начинаются с инициирующего кодона (обычно АУГ, но может быть и ГУГ) и заканчиваются одним из терминирующих кодонов (УАА, УАГ или УГА). Межцистронные области имеют размер от 1 до 40 и более нуклеотидов. Иногда межцистронные области могут отсутствовать, при этом, последний нуклеотид одного цистрона может являться первым нуклеотидом следующего цистрона. 11. Охарактеризуйте особенности строения и-РНК эукариот. и-РНК эукариот являются моноцистронными и составляют 2 – 6 % от всей РНК в клетке. На их 5’-конце имеется кэп – нуклеотидная последовательность, содержащая 7-метилгуанозин, присоединенный через трифосфатную группировку к первичному транскрипту и необходим для защиты м-РНК от эндонуклеаз, связывания белковых факторов при взаимодействии с р-РНК в рибосоме, играет важную роль в инициации синтеза белка. На 3’-конце большинства и-РНК эукариот имеется полиА-последовательность. Некоторые и-РНК эукариот не имеют полиА-последовательности, например, и-РНК гистонов. ПолиА- последовательность не закодирована в генах, поэтому полиаденилирование осуществляется после транскрипции (в ядре) ферментом полиаденилатполимеразой. ПолиА-последовательность имеет размер около 50 – 400 нуклеотидов. В цитоплазме она постепенно укорачивается и определяет время жизни и-РНК. Таким образом, эта последовательность защищает и-РНК от деградации последовательности, кодирующей полипептидную цепь. Кроме того, она способствует транспорту и-РНК из ядра в цитоплазму. На эффективность трансляции полиА-последовательность влияния не оказывает. Кодирующая, или транслируемая, область и-РНК начинается с инициирующего кодона и заканчивается одним из трех терминирующих кодонов. На 5’-и 3’- флангах иРНК располагаются нетранслируемые области. 12. Охарактеризуйте особенности строения и функции р-РНК. Рибосомные РНК (р-РНК) Являются основными функциональными и структурными компонентами рибосом, составляющие от 5о до 70 % от их массы. р-РНК определяют размеры и форму рибосомальных единиц, образуя каркас для размаещения рибосомных белков. для обозначения типов р-РНК используют единицы Сведберга - S, которые характеризуют их размеры и форму на основании скорости седиментации при ультрацентрифугировании. Малая субъединица рибосомы 30S у прокариот и 40S у эукариот содержит одну молекулу р-РНК, которая обозначается 16S р-РНК у прокариот и 18S р-РНК у эукариот. Длина этих р-РНК колеблется от 600 до 1900 нуклеотидных последовательностей. Большая рибосомальная единица 50S у прокариот и 60S у эукариот содержит соответственно высокомолекулярную 23S р-РНК и 28S р-РНК. Длина колеблется от 2000 до 4800 нуклеотидных последовательностей. Наряду с этим у прокариот содержится низкомолекулярная 5S р-РНК, длиной 120 н.п., для эукариот - 5,8S р-РНК, длиной 160 н.п. 13. Опишите особенности мя-РНК и мц-РНК. Малые ядерные РНК – короткие стабильные молекулы РНК, большинство которых в составе нуклеопротеидных частиц присутствуют в ядре, обнаружены в составе сплайсингосом млекопитающих. В их составе обнаружено в большом количестве урацил и его модифицированные формы (U-РНК). Малые цитоплазматические РНК (мцРНК) функции их до сих пор не установлены. Большинство из них ассоциируются с крупными семействами последовательностей, содержащие как гены, так и антигены |