1. Антибиотики. Классификация антибиотиков по источнику получения, способу получения, механизму, спектру и типу действия
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
14. Клеточная стенка бактерий. Особенности строения грамположительных и грамотрицательных бактерий. Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры. Функции кл. стенки: 1)Механическая защита 2)Формообразование 3) Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества. 4) Обуславливает антигенные свойства 5) Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ. 1. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты. 2. В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид. Методы окраски: Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. 1. Простые методы окраски(одним красителем) – красители анилинового ряда Кислые красители (Хромофор или красящий ион – анион-):эритрозин, кислый фуксин, эозин Основные красители(Хромофор или красящий ион – катион+):генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин Описание метода: Преимущественно используют основные красители, которые связываются кислые компоненты клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно- спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены. 2. Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Различают методы: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса 1) По Грамму (определение толщины пептидогликановогослоя) 1. генцианвиолет (син) 2. люголь(водный раствор йода-KI) (фиксирует окраску) 3. спирт 96 % - 5-10 сек. ГРАММПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. ГРАММОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и иодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются водным фуксином(1 мин), приобретая красный цвет. 2) По Целю-Нильсону (определение жировосковых свойств) 1. окр карболовый фуксин Целя (3-5 мин до нагревания) 2. диффундирующее вещество –H2SO4 на 5-10 сек. 3. промыть водой Смотрим: кислотоустойчивые – много липидов; неустойчивые(бесцветные) – мало. 4. Наносим метиленовый синий на 3-5-минут или генцианвиолет на 1-2 мин и промываем водой. 15) Клиническая микробиология, ее задачи. Критерии этиологической диагностики. Клиническая микробиология - раздел медицинской микробиологии, изучающий взаимоотношения, складывающиеся между организмом и микробами в норме, при патологии, в динамике воспалительного процесса с учетом проводимой терапии до констатации клиницистом состояния клинического или полного выздоровления. Задачи клинической микробиологии: • Изучение биологии и роли УПМ в этиологии и патогенезе гнойно-воспалительных заболеваний человека. • Разработка и использование методов микробиологической диагностики, специфической терапии и профилактики заболеваний, вызванных микробами, встречающихся в неинфекционных стационарах. • Исследование микробиологических аспектов проблем ВБИ, дисбактериоза, лекарственной устойчивости микробов. • Микробиологическое обоснование и контроль за антимикробными мероприятиями в больничных стационарах. Для установления этиологической роли патогенных микробов достаточны выделение микроба из материала от больного, обнаружение в сыворотке крови специфеческих антител в диагностическом титре или сероконверсии в ходе болезни в 4 раза и более, корреляция между выделенным микробом и клинической картиной болезни. Критерии этиологической роли УПМ более сложны. Основное значение в установлении этиологии заболевания имеют два кри- терия. • Выделение УПМ из крови и ликвора, что подтверждает этиологическую роль этого УПМ. • Численность популяции обнаруженного в пораженном органе (кроме крови и ликвора) УПМ, так называемое критическое число, которое рассчитывают на 1 мл исследуемого материала (мочи, мокроты). Обычно за такое критическое число для бактерий принимают дозу 105 КОЕ/мл, для грибов и простейших - 103-104. В случае выделения из патологического материала нескольких видов или вариантов УПМ за ведущего возбудителя принимают количественно доминирующую популяцию. Сле- дует учитывать, что численность популяции возбудителя в процессе болезни меняется: при переходе в хроническую форму, в период выздоровления и ремиссии, в процессе химиотерапии, в присутствии конкурента она существенно снижается. (Дополнительные критерии установления этиологической роли УПМ изложены в материалах диска.) 16) Методы культивирования вирусов. Вирусологический метод, этапы. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах. Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Основные методы культивирования вирусов: 1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных; 2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы выращивают в инкубаторе 7—10 дней, а затем используют для культивирования. В этой модели все типы зачатков тканей подвержены заражению. Но не все вирусы могут размножаться и развиваться в куриных эмбрионах. В результате заражения могут происходить и появляться: 1) гибель эмбриона; 2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы; 3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования); 4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов). Различают следующие типы культур тканей: 1) перевиваемые – культуры опухолевых клеток; обладают большой митотической активностью; 2) первично трипсинизированные – подвергшиеся первичной обработке трипсином; эта обработка нарушает межклеточные связи, в результате чего выделяются отдельные клетки. Источником являются любые органы и ткани, чаще всего – эмбриональные (обладают высокой митотической активностью). Для поддержания клеток культуры ткани используют специальные среды. Это жидкие питательные среды сложного состава, содержащие аминокислоты, углеводы, факторы роста, источники белка, антибиотики и индикаторы для оценки развития клеток культуры ткани. О репродукции вирусов в культуре ткани судят по их цитопатическому действию, которое носит разный характер в зависимости от вида вируса. Основные проявления цитопатического действия вирусов: 1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них; 2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития; 3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки; 4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения); 5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция). Вирусологический метод диагностики Вирусологический – выделение вирусов из исследуемого материала с последующей их идентификацией (установление вида и типа вируса посредством серологических реакций). Этапы вирусологического метода исследования: 1. Взятие материала (выбор материала определяется клиническими признаками заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения), транспортировка в лабораторию и подготовка к исследованию (для подавления сопутствующей бактериальной флоры обрабатывают антибиотиками). 2. Заражение исследуемым материалом чувствительной модели. Вирусы в отличии от бактерий не растут на питательных средах, т.к. являются абсолютными (облигатными) паразитами, поэтому для их культивирования применяются особые модели: Ø в организме восприимчивых животных; Ø в куриных эмбрионах (овокультуры); Ø в культуре клеток. 3. Культивирование вируса в зараженной модели при стандартных условиях (оптимальная температура, продолжительность культивирования). 4. Индикация (обнаружение) вируса в зараженной модели. 5. Идентификация выделенного вируса в серологических реакциях. Достоинство вирусологического метода – 100% достоверность. 17) Методы микроскопического исследования (люминесценция, темнопольня, фазово-контрастная, электронная микроскопия). Люминесцентная микроскопия- метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальным светящимися люминесцентными красителями – флуорохромами (напр. акридовый оранжевый). Лучи света от сильного источника пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуорохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. В окуляр помещают запирающий желтый светофильтр, чтоб не мешал наблюдению. Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуорохромами, не причиняющими вреда микробным клеткам. Темнопольная микроскопия –препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не падающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата результате отражения, преломления или дифракции. Микробные клетки и др частицы представляются ярко светящимися на черном фоне. В темнопольной микроскопии используют специальный конденсор (пораболоид-конденсор или кордиоид-конденсор) и обычные объективы. Внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру. Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности. Фазово-контрастная микроскопия включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света и фазово- контрастные объективы, в которых в главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Существенными недостатками являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов. Электронная микроскопия- Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов. Существует два отдельных направления электронной микроскопии: сканирующая (растровая) микроскопия (РЭМ, СЭМ, SEM), используемая для толстых образцов и просвечивающая микроскопия (ПЭМ, TEM), работающая с тонкими срезами биологических объектов. РЭМ последовательно сканирует поверхность электронно- плотного объекта, регистрируя для каждой его точки такие процессы, как генерация обратно рассеянных электронов, вторичных электронов, характеристического рентгеновского излучения, катодолюминисценции. ПЭМ получает изображение за счёт рассеивания электронов проходящих сквозь тонкий образец, по аналогии с оптическим микроскопом, объект в котором поглащает и рассеивает свет. Ключевую роль в электронной микроскопии играет этап подготовки образца. В центре представлено оборудование как для классической пробоподготовки с химической фиксацией образца, так и оборудование для фиксации образца методом быстрого замораживания, который позволяет одномоментно остановить все биохимические процессы в образце и избежать артефактов присущих химической фиксации. 18) Метод определения чувствительных бактерий к антибиотикам. Интерпретация результатов. Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют: • Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). • Метод дисков — качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату. • Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов. Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри. Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией. На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам. Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 —10 7 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика. Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов. К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз. Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест- бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл. Определение способности S. aureus продуцировать бета- лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета- лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска). |