1. Медицинская микробиология. Предмет, задачи, методы, связь с другими науками. Значение медицинской микробиологии в практической деятельности врача
 Скачать 0.96 Mb.
|
|
Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфи чески «узнавать» друг друга и при достаточной их концентра ции самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, со левых и водородных связей. Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру: 1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм; 2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодей ствии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала форми руются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа); 3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки; 4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы). Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхо да вирусного потомства из клетки. Первый тип — взрывной — характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип — почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нук леокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточ ной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячива ния образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «поч ка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При та ком механизме клетка может продолжительное время продуци ровать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции. Время, необходимое для осуществления полного цикла реп родукции вирусов, варьирует от 5—6 ч (вирусы гриппа, нату ральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, адено вирусы и др.). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репро дукции. Взаимодействие вируса с клеткой хозяина. Существует несколько типов взаимодействия с клеткой. Жизненный цикл вирусов: 1. Продуктивная инфекция протекает в несколько стадий: 1. Адсорбция вириона на клетке – осуществляется за счёт специфического взаимодействия антирецептора вириона с комплементарным рецепторами мембраны клетки хозяина. Не зависит от температуры. 2. Проникновение вируса в цитоплазму клетки (пенетрация). У просто устроенных вирусов осуществляется путем эндоцитоза – образуется эндоцитарная вакуоль, в которую заключен вирион. У сложноустроенных вирусов осуществляется путем слияния клеточной мембраны с мембраной суперкапсида. 3. Депротеинизация (раздевание вируса). Осуществляется клеточными ферментами, разрушающими капсид. При этом вирусный геном освобождается от капсида (белка). Вирус на время как бы исчезает. Эта стадия называется эклипс. 4. Синтез вирусных компонентов (генома и белка). Синтез разобщен во времени и протекает в разных частях клетки. На этой стадии синтезируются вирусные белки и нуклеиновые кислоты. Стратегия вирусного генома ДНК - содержащие вирусы: аденовирусы, ретровирусы (онкогенны), вирус гепатита В, герпес; • В ядре пораженной клетки с вирусной ДНК синтезируется информационная РНК с учатием ДНК-полимеразы. Днк – иРНК – ДНК вируса. РНК-содержащие вирусы • У вирусов с +РНК пикорна-, тогавирусы., гепатит А, Е и др., функцию иРНК выполняет сам геном. Все компоненты синтезируются только в цитоплазме. РНК вируса - +РНК – белок вируса. • У вирусов с –РНК орто-, парамиксо-, рабдовирусы и др. В цитоплазме пораженной клетки. РНК вируса – РНК – иРНК – белок вируса. • РНК-содержащие ретровирусы (ВИЧ) имеют обратную транскриптазу или ревертазу. В ядре пораженной клетки с РНК синтезируется ДНК вируса. РНК вируса – РНК – ДНК – иРНК – белок вируса Ферменты, осуществляющие синтез вирусных нуклеиновых кислот: • ДНК-зависимая – ДНК-полимераза; • ДНК-зависимая – РНК-полимераза; • РНК-зависимая – РНК-полимераза; • РНК-зависимая – ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). 5. Сборка вирионов • Может происходить в цитоплазме или на внутренней поверхности клеточной мембраны. • Осуществляется по принципу самосборки на основе белок-белкового и белок-нуклеинового узнавания. 6. Выход из клетки. • Просто устроенные вирионы выходят из клетки путем взрыва; • Сложно устроенные выходят методом почкования. 2. Стадия интеграции У вирусов герпеса, гепатита В, ВИЧ в цикле репродукции имеется стадия интеграции (встраивания) вирусного генома в геном клетки хозяина. Интегрированная в клеточный геном вирусная ДНК называется провирусом. Культивирование вирусов !Вирусы не растут на питательных средах!. Для культивирования вирусов используются биологические модели: 1. Культура клеток; • Неперевиваемые культуры; • Полуперевиваемые культуры; • Перевиваемые клетки; 2. Куринные эмбрион; 3. Лабораторное животное. 21. Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Методы культивирования вирусов. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах. Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей живот ных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Приготовление первичной культуры клеток складывает ся из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания получен ной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови. Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохра няются на протяжении нескольких десятков пассажей. Перевиваемые однослойные культуры клеток приготов ляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю щих способностью длительно размножаться in vitro в определен ных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки ам ниона человека, почек обезьяны и др. К полуперевиваемым культурам относятся диплоид ные клетки человека. Они представляют собой клеточную систе му, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток использу емой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают зло качественного перерождения и этим выгодно отличаются от опу холевых. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), кото рое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности. Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорби ровать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее по становки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На по верхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты. Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жид кости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инку бации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса при нимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз. Более точным количественным методом учета отдельных ви русных частиц является метод бляшек. Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно вы сокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздей ствиям. Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ря да вирусов в диагностических целях, а также для приготов ления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим из менениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его обо лочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами. К недостаткам данного метода относятся невозможность об наружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очист ку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препа ратов. Лабораторные животные. Видовая чувствительность живот ных к определенному вирусу и их возраст определяют репродук тивную способность вирусов. Во многих случаях только ново рожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки). Преимущество данного метода перед другими состоит в воз можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуциру ются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся кон таминация организма подопытных животных посторонними ви русами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данно го вируса, что удлиняет сроки исследования. 22. Вирусы бактерий – фаги. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги. Профаг. Лизогения. Фаговая конверсия. Применение фагов в биотехнологии, микробиологии и медицине. Бактериофаги — вирусы бактерий, обладающие способностью специфически про никать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вы зывать их растворение (лизис). Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги. Ви рулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, авто номно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Про цесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий и весьма схож с процессом взаимодей ствия вирусов человека и животных с клеткой хозяина. Однако для фагов, имеющих хвостовой отросток с сокращающим ся чехлом, он имеет особенности. Эти фаги адсорбируются на по верхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостово го отростка. В результате активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе «прокалывания» клеточной стенки бактерии принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержаща яся в головке, проходит через полость хвостового стержня и ак тивно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структур ные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки. После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых ча стиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного ос мотического давления происходит разрушение клеточной стен ки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30—40 мин. Процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии. Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризу ется определенной степенью специфичности. По специфичнос ти действия различают поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий. Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае гено мом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосо мы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наслед ству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Био логическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бакте рий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Это название отражает способность профага самопроизвольно или под действи ем ряда физических и химических факторов исключаться из хро мосомы клетки и переходить в цитоплазму, т. е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии. Лизогенные культуры по своим основным свойствам не от личаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств мик роорганизмов под влиянием профага получило название фаго вой конверсии. Последняя имеет место у многих видов мик роорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захва тить часть хромосомы клетки и при лизисе последней перено сит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клет ка станет лизогенной, она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фак тором изменчивости микроорганизмов. Практическое применение фагов. Бактерио фаги используют в лабораторной диагнос тике инфекций при внутривидовой иденти фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко торый вызвал ее лизис (образование сте рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми ологическое маркирование). Выделение бак терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения. По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследова ния проводят при эпидемиологическом ана лизе вспышек инфекционных болезней. Фаги применяют также для лечения и про филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, ста филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен терально или местно в виде жидких, таблети-рованных форм, свечей или аэрозолей. Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получе ния рекомбинантных ДНК. 23. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике. Основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ. Механизм их антибактериального действия. Влияние физических факторов. Влияние температуры. Различные группы микроорга низмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при вы сокой — термофилами. К психрофильным микроорганизмам относится боль шая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, све тящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бакте рии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при темпера туре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свой ства бактерий меняются. Интервал температур, при кото ром возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, прибли жаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий. Мезофилы включают основную группу патогенных и услов но-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С. При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развива ются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при темпе ратуре 250—300 °С и давлении 262 атм. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания на воза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компос том. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассмат ривают как показатель загрязненности почвы. Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких тем ператур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном со стоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С). |