Гистология. экзамен. 1. Методы изготовления препаратов для световой микроскопии. Сущность и методы фиксации. Способы уплотнения (заливки). Метод замораживания. Сущность и методы окраски микропрепаратов и их заключение в бальзам, смолы, желатин
 Скачать 148.71 Kb.
|
|
Генетическая инжене́рия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма(клеток), осуществления манипуляций с генами, введения их в другие организмы и выращивания искусственных организмов после удаления выбранных генов из ДНК. Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, генетика, микробиология, вирусология. Учёные Фредерик Сенгер и американский учёный Уолтер Гилберт (Нобелевская премия по химии 1980 года). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках — это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов — химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку. Все методы генетической инженерии применяются для осуществления одного из следующих этапов решения генно-инженерной задачи: 1. Получение изолированного гена. 2. Введение гена в вектор для переноса в организм. 3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм. 4. Преобразование клеток организма. 5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы. Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит также были удостоены Нобелевской премии (1978 г.) 5. Основные положения клеточной теории на современном этапе развития науки. Понятие о клетке, как основной единице живого. Общий план строения клеток эукариот: Неклеточные структуры как производные клеток. Взаимосвязь формы и размеров клеток с их функциональной специализацией. Клеточная теория — это обобщенное представление о строении клеток как единиц живого, об их воспроизведении и роли в формировании многоклеточных организмов. Первым, кто наблюдал наименьшие единицы в составе многоклеточных, был Роберт Гук (1665). Прогресс в изучении морфологии клетки связан с успехами микроскопирования в XIX в., когда были описаны ядро и протоплазма (Я. Пуркинье, Р. Броун и др.). К тому времени изменились взгляды на строение клеток. Многочисленные данные, касающиеся строения животных и растений, позволили подойти к обобщениям, которые впервые были сделаны Т. Шванном (1838) и легли в основу сформулированной им клеточной теории. Его главным достижением является утверждение, что клетки, из которых состоят как растения, так и животные, сходны между собой и возникают единообразным путем. Заслуга Т.Шванна заключалась в том, что он оценил значение клетки как основного структурного компонента организма. Дальнейшее развитие и обобщение эти представления получили в работах немецкого патолога Р. Вирхова (1858). Создание клеточной теории стало важнейшим событием в биологии. Клеточная теория оказала значительное влияние на развитие биологии и медицины, послужила главным фундаментом для становления таких дисциплин, как эмбриология, гистология. Принятие принципа клеточного строения организма оказало огромное влияние на физиологию, переведя ее на изучение реально функционирующих единиц — клеток. Она дала основы для научного понимания жизни, объяснения эволюционной взаимосвязи организмов, понимания индивидуального развития. В настоящее время клеточная теория гласит: 1. Клетка — наименьшая единица живого. Согласно одному из современных определений, живые организмы представляют собой открытые, саморегулирующиеся и самовоспроизводящиеся системы, важнейшими функционирующими компонентами которых являются белки и нуклеиновые кислоты. Живому свойствен ряд признаков: способность к воспроизведению (репродукции), использование и трансформация энергии, метаболизм, чувствительность, адаптация, изменчивость. У животных организмов неклеточные структуры -симпласты, синцитии и межклеточное вещество. Симпласты —крупные образования, состоящие из цитоплазмы (протоплазмы) с множеством ядер (примеры - мышечные волокна позвоночных, наружный слой трофобласта плаценты ). Возникают вторично в результате слияния отдельных клеток или при делении одних ядер без разделения цитоплазмы (цитотомии). Синцитии (соклетия) характеризуются тем, что после деления исходной клетки дочерние остаются связанными друг с другом с помощью тонких цитоплазматических перемычек (например, сперматогониев). межклеточное вещество -расположено между клетками, имеет различное строение у разных видов тканей. 2. Сходство клеток разных организмов по строению. Клетки могут иметь самую разнообразную внешнюю форму,но при этом сходство в строении клеток определяется одинаковостью общеклеточных функций, связанных с поддержанием самой живой системы, указывает на общность происхождения всех эукариотических организмов. практически все клетки имеют 3 основных компонента: * плазматическую мембрану - отделяет содержимое клетки от внеклеточной среды, * ядро - содержит наследственный материал (ДНК), связанный с ядерными белками, * цитоплазму - это внеядерная часть клетки, включающая гомогенную гиалоплазму и многочисленные цитоплазматические структуры. Исключение составляют эритроциты и роговые чешуйки кожи (ороговевшие кератиноциты), которые лишены ядра. Различие клеток в многоклеточном организме, обусловленное специализацией их функций, связано с развитием особых функциональных клеточных структур — органелл специального значения. Индивидуальное развитие, от одной клетки до многоклеточного зрелого организма, — результат последовательного, избирательного включения работы разных генов в различных клетках. Это приводит к появлению клеток со специфическими структурами и особыми функциями (дифференцировкой). Дифференцировка- активность разных генов в разных клетках, проявляемой по мере развития многоклеточного организма. 3. Размножение клеток путем деления исходной клетки. Т. Шванн в своих обобщениях подчеркивал одинаковость принципа развития клеток, как у животных, так и у растений. Сформулированное позднее Р. Вирховым положение «всякая клетка от клетки» можно считать биологическим законом. Размножение клеток, прокариотических и эукариотических, происходит только путем деления исходной клетки, которому предшествует воспроизведение ее генетического материала (репродукция ДНК). У эукариотических клеток единственно полноценным способом деления является митоз, или непрямое деление. При этом образуется специальный аппарат клеточного деления, клеточное веретено, с помощью которого равномерно и точно по двум дочерним клеткам распределяют хромосомы, до этого удвоившиеся в числе. 4. Клетки как части целостного организма. Специализация каждого вида клеток достигается в процессе дифференцировки. В этот процесс вступают стволовые клетки, способные делиться; в ряду же появляющихся клеток постепенно образуются структуры, необходимые для выполнения определённых функций; теряются какие-то другие, ненужные уже структуры; при этом на определённом этапе дифференцировки обычно утрачивается способность к делению. 6.Биологическая мембрана как основа строения клетки. Строение, основные свойства и функции. Структурно-химические особенности. Характеристика надмембраного слоя (гликокаликса) и подмембраного (кортикального слоя) специализированные структуры клеточной оболочки: микроворсинки, реснички, базальные инвагинации. Их строение и функция. Плазмалемма или плазматическая мембрана – это универсальная структура клетки, которая представляет собой тонкую биологическую оболочку покрывающую клетку, ее ядро и разграничивающая цитоплазму на компарменты. Все мембраны состоят из белков, липидов и углеводов. Белки составляют 50-60% ее массы, липиды 30-40%, углеводы 5-10%. Липиды в мембране образуют билипидный слой (двойной слой)- в него входят фосфолипиды, сфинголипиды и холестерин. Молекула липидов состоит из двух частей - наружная глобулярная, полярная и гидрофильная – называется головкой. Внутренняя- фибриллярная, неполярная и гидрофобная- хвост. Белки располагаются среди липидов в виде отдельных молекул, по принципу мозаики (мозаичная модель строения Сингер-Никольсона). По расположению выделяют 3 вида белков: *интегральные белки – молекула полностью лежит в слое липидов. *полуинтегральные белки - наполовину погружены в билипидный слой. *примебранные белки – молекула белка находится на поверхности слоя липидов. Углеводный компонент мембраны- гликопротеины (интегральные молекулы белком) коволентно связанные с коротными линейнными или разветленными цепочками углеводов в наружных слоях. В их состав входят галактоза, манноза, фруктоза, сахароза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, пентозы (арабиноза и ксилоза), нейроминовая кислота. (Важный компонент для функционирования плазм. мембраны) Основу плазмалеммы составляет липопротеидный комплекс, который имеет толщину 10нм. Поверхностный комплекс состоит из плазматической мембраны (цитолеммы)- гликокаликса и кортикального слоя. Снаружи от плазмалеммы располагается надмембранный слой – гликокаликс( толщина 3-4 нм) – внешний по отношению к липопротеиновой мембране слой, содержащий полисахаридные цепочки мембранных интегральных белков- гликопротеинов и гликолипидов. Имеет желоподобную консистенцию, участвует в образование межклеточных контактов, служит маркером клеток организма для иммунного надзора. *При использование спец.методов выявление полисахиродов( краситель рутеиновый красный) видно, как они образуют чехол поверх плазм.мембраны. В гликокаликсе могут содержаться белки, не связанные непосредственно с билипидным слоем- белки-ферменты, которые участвует в внеклеточном расцепление различных веществ-углеводов .белков, жиров и тд. Кортикальный слой- прилежит к цитолемме с внутренней стороны, содержит большое количество элементов цитоскелета- микрофиламентов и микротрубочек. По биол.роли мембранные белки можно разделить на: структурные, рецепторные белки, ферменты и белки-переносчики. На электроннограмме в плазмолемме четко определяются три слоя: -наружный (электронноплотный); -внутренний (электронноплотный); -промежуточный (с низкой электронной плотностью) Белковые молекулы встроены в билипидный слой мембраны локально и не образуют сплошного слоя. Функция плазм.мембраны: Барьерная- отделяет клетку от внешней среды и других клеток, ядро отделено от цитоплазмы, мембр.органеллы –от гиалоплазмы. –плазмалемма так же ограничивает поток низко- и высомолекулярных веществ обе стороны. Рецепторная функция связана с локализацией на плазмалемме спец.структур, участвующих в специфическом «узнавание» хим. и физ. Факторов. Это белки-рецепторы для гормонов, для узнавания поверхности сосед. клеток, вирусов. К этой группе относятся фоторецепторные белки. Плазм. Мембрана выполняет функцию первичного клеточного анализатора. Транспортная функция: Пассивный транспорт- способный перенос ряда веществ, таких как вода, соли и веществ низким молекулярным весом за счет белков-переносчиков. Осуществляется за счет транспортных белков- пермеаз. Уни-порт- белки проводят одно вещество в одном направление. Сим-порт- проводят несколько веществ одновременно. Анти-порт- вместе с импортом одного вещества выводят из клетки другое. Активный транспорт- транспорт веществ против градиента концентрации, т.е транспорт молекулы из среды с низкой концентрацией в среду с более высокой, за счет использования энергии АТФ. (калий-натриевый насос) Транспорт макромолекул и их комплексов внутрь клетки и из нее осуществляется посредством везикулярного переноса. Экзоцитоз- вынос из клетки макромолекулярных продуктов Эндоцитоз- поглощение макромолекул, путем захвата определенным участком плазмалеммы и обволакивания внеклеточного материала, заключение его в мембр.вакуоль ,возникшую за счет выпачивания плазм.мембраны и перемешение ее внутрь клетки. Пиноцитоз- активное поглощение жидких продуктов, с формированием в цитоплазме пузурьков, содержащих жидкость. Фагоцитоз- захват, поглощение и переваривания крупных частиц.(впервые описан И.И.Мечниковым) 4.Образование межклеточных контактов. Специализированные структуры клеточной оболочки: микроворсинки, реснички, базальные инвагинации. Микроворсинки- специализированные выросты плазматической мембраны эпителиальных клеток. Длина 500-3000 нм, диаметр 50-100 нм. Количество в одной клетке достигает нескольких тыс. Иногда расположение их упорядочено, например, в исчерченных (щёточных) каёмках эпителиальных клеток тонкого кишечника. М. находятся на расстоянии около 20 нм друг от друга. Функция: служат для увеличения клеточной поверхности. Из М. состоят и кутикулы у позвоночных животных. Реснички- тонкие ните- или щетинковидные выросты поверхности клеток, способные совершать ритмические движения. В основании ресничек и жгутика в цитоплазме видны хорошо красящиеся мелкие гранулы — базальные тельца Длина 5—10 мкм, длина жгутиков 150 мкм. Представляет собой тонкий цилиндрический вырост цитоплазмы с постоянным диаметром 200 нм. Вырост от основания до самой его верхушки покрыт плазматической мембраной. Внутри выроста - аксонема («осевая нить»), которая состоит в основном из микротрубочек. Проксимальная часть реснички (базальное тело) погружена в цитоплазму. Диаметры аксонемы и базального тельца одинаковы (около 150 нм). Базальное тельце (кинетосома) состоит из 9 триплетов микротрубочек, имеет динеиновые «ручки». Часто в основании реснички лежит пара базальных телец. формула (9 x 3) + 0 Аксонема (filamentum axiale) в своем составе имеет центриоли 9 дублетов микротрубочек с динеиновыми «ручками», образующих стенку цилиндра аксонемы, в центре аксонемы -пара центральных микротрубочек. Формула: (9 x 2) + 2. Базальное тельце и аксонема структурно связаны друг с другом и составляют единое целое: две микротрубочки триплетов базального тельца являются микротрубочками дублетов аксонемы. Основной белок — тубулин не способен к сокращению, укорочению. Белок, обеспечивающий сокращение это белок «ручек» — динеин, он обладает АТФ-азной активностью. У человека реснички имеет эпителий дыхательных путей, евстахиевых труб, семявыносящих канальцев, яйцеводов, матки. Функция: локомоторная- обеспечивает перемещение клетки в жидкой среде, а в тех случаях, когда клетки фиксированы на субстрате, вызывает токи жидкости в окружающей среде. 7.Общая характеристика межклеточных взаимодействий. Классификация. Межклеточные соединения (контакты): простой контакт, соединения типа замка, плотные соединения, десмосомы, щелевидные контакты (нексусы), синоптические соединения (синапсы). Плазмолемма многоклеточных животных организмов принимает активное участие в образовании специальных структур — межклеточных соединений, обеспечивающих межклеточные взаимодействия. Они лежат в основе интегративных свойств организма, тонкой сети регуляторных и авторегуляторных процессов, являются одним из механизмов реализации генетической информации в процессе индивидуального развития. Составляют основу деятельности иммунной, гуморальной и различных «этажей» нервной системы. Межклеточные контакты играют ключевую роль в формообразовании ткани или органа. По своим функциональным свойствам межклеточные контакты подразделяются: Контакты простого типа: а) простые межклеточные соединения, б) интердигитации (пальцевые соединения). 2) Контакты сцепляющего типа: а) десмосомы б) адгезивный поясок. 3) Контакты запирающего типа: плотное соединение (запирающая зона) 4) Контакты коммуникационного типа: а) щелевидные соединения (нексусы), б) синапсы Простое межклеточное соединение осуществляется путем сближения плазмолемм клеток до расстояния 15-20нм и взаимодействия белков плазматических мембран – кадгеринов. Благодаря кадгерину клетки в процессе гистогенеза и органогенеза узнают друг друга и объединяются в единую структуру, например, эпителиальный пласт. (Раковые клетки не узнают друг друга). Пальцевидные соединения (интердигитации) образуются за счет взаимной инвагинации (впячивания) обеих плазмолемм в начале в одном, а затем в другом. Это один из трех видов контактов между кардиомиоцитами. Десмосома представляет небольшое округлое образование, построенное с участием плазмолемм соседних клеток. Десмосомы построены из белка десмоплакина, который образует слой на внутренней стороне каждой мембраны. К слою десмоплакина присоединяются пучки промежуточных филаментов. Промежуточные филаменты в разных тканях представлены разными белками, например, в эпителии – кератином, в мышечной – десмином. С наружной стороны мембраны пространство между десмосомами заполнено утолщенным слоем гликокаликса. Гликокаликс десмосом пронизан склеивающим (адгезивным) белком – десмоглеином. Функциональная роль десмосом заключается главным образом в механической связи между клетками. |