Гистология. экзамен. 1. Методы изготовления препаратов для световой микроскопии. Сущность и методы фиксации. Способы уплотнения (заливки). Метод замораживания. Сущность и методы окраски микропрепаратов и их заключение в бальзам, смолы, желатин
 Скачать 148.71 Kb.
|
|
Гистология 1.Методы изготовления препаратов для световой микроскопии. Сущность и методы фиксации. Способы уплотнения (заливки). Метод замораживания. Сущность и методы окраски микропрепаратов и их заключение в бальзам, смолы, желатин. Основным объектом исследования являются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных структур. Они могут приставлять собой: мазок (мазок крови, костного мозга, слюны), отпечаток (селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (соединительной или брюшной, плевры) или тонкий срез. Наиболее часто используется срез ткани или органа. Вследствие того, что структур имеют слабый контраст и плохо выявляются в обычном световом микроскопе и требуют использования специальных микроскопов (фазово-контрастного и т.д.), поэтому используются обработанные препараты. Этапы изготовление микропрепарата для светового микроскопа. 1.Взятие материала и его фиксация. 2. Уплотнение материала. 3. Приготовление срезов. 4. Окрашивание или контрастирование срезов. 5. Заключение в бальзам, смолы, желатин (для световой микроскопии). Взятие материала и его фиксация: Фиксация полученного материала это воздействие на него химическими веществами и физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей и сохраняет их структуру. Физические факторы фиксации: замораживание (твердой углекислотой, жидком азоте, кислороде), высокой температурой, рентгеновскими лучами. Эти факторы вызывают гибель бактерий и инактивируют собственные ферменты ткани, что обеспечивает сохранение гистологического материала. Химические фиксаторы: взывают гибель микробов и собственных ферментов тканей, стабилизируют структуру объекта. Различают простые и сложные: Простые фиксаторы состоят из одного химического вещества ( например, формалин, уксусная кислота, спирт), но эти фиксаторы нарушают структуры гистологического материала. Так, например формалин вызывает сморщивание препарата, уменьшение его в размерах, а углекислая кислота наоборот набухание. Поэтому чаще всего используют сложные фиксаторы, состоящие из простых фиксаторов, в которых их отрицательное действие не проявляется. Так, например фиксатор ФСУ состоит из 4 частей формалина, 1 части спирта и 0,3 частей уксусной кислоты. Он вызывает незначительные изменения структуры гистологического материала. Уплотнение материала - после фиксации кусочки тканей обезвоживают в спиртах, возрастающей концентрацией. Спирты замещают ксилолом, ксилол замещают парафином. Материал, заключенный в твёрдую массу парафина можно нарезать. Приготовление срезов - срезы толщиной от 5-10 мкм получают на специальном приборе - микротоме. Срезы приклеиваются на предметное стекло. Парафин растворяется в ксилоле, ксилол замещают спиртами, а спирт замещают водой. Окраска препаратов Окрашивание срезов в световой микроскопии используют для увеличения контрастности отдельных структур объекта. Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные красители. В гистологии стандартными красителями являются гематоксилин и эозин. Натуральный основный краситель гематоксилин связывается с кислотными компонентами клеток и межклеточного вещества и дает цветную синюю соль - явление базофилия. Структуры, окрашиваемые основными красителями, называют базофильными. Кислотный краситель эозин, связываясь со щелочными компонентами клетки и межклеточного вещества, дает красную или розовую соль – явление ацидофилия или оксифилия. Структуры, окрашиваемые кислотными красителями, называют ацидофильными или экзофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители называют нейрофильными (гетерофильными). Так, например краситель толуилиновый синий, связываясь с компонентами клетки и межклеточного вещества, может менять свой цвет – явление метахромзия. Метахромазия- способность хим. веществ менять свою окраску, при связывание красителя с компонентами клетки или межклеточного вещества. Заключение срезов в бальзам, смолы или желатин Окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются канадским бальзамов, смолой или желатином под покровным стеклом. После высыхания препарат прозрачен и может быть подвергнуть изучению под микроскопом. Метод замораживания. Метод замораживания – скалывания - используют для изучения деталей строения мембран и межклеточного вещества. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре -160С. При исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов, на внутреннею поверхность полученных половинок мембраны напыляют металлы (платина, палладий, уран). Изучают с помощью ТЭМ или микрофотографии. Метод замораживания-травления - используют для изучения верхней поверхности мембран. После быстрого замораживания клеток, блок раскалывают лезвием ножа, кристаллы льда удаляют путем выгонки воды в вакууме, участки клетки оттеняют, напыляют тонкую пленку тяжелого металла (платины) Метод криоэлектронной микроскопии - замороженный тонкий слой образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при температуре -160С. Эти методы позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов. 2.Техника микроскопирования в световых микроскопах. Особенности микроскопии в ультрафиолетовых лучах, люминесцентная микроскопии, фазово-контрастная микроскопия, интерференционная микроскопия, лазерно конфокальная микроскопия. Световой микроскоп: источник освещения - естественный или искусственный свет, который собирается в конденсаторе и направляется в объектив. Проходя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива, которые строят первичное изображение, увеличивающееся с помощью линз окуляра. Главная часть микроскопа - объектив. Выделяют: объективы малого разрешения - увеличивают в 3-10 раз, объективы большего разрешения – увеличивают в 20 раз. Иммерсионные объективы – могут увеличивать в 90 раз, при этом средой между объектом и объективом служит иммерсионное масло. Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток и микроорганизмов поглощать УФ-излучение с определённой длиной волн (400-250 нм). Таким свойством обладают нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты, пиримидиновые и пуриновые основания и др. с помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество этих веществ, а в исследовании живых клеток – их изменения в процессе жизнедеятельности. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение регистрируется на фотопластинки или с помощью специальных устройств (люминесцентного экрана, электронно-оптического преобразователя). Флуоресцентная микроскопия (люминесцентная) основа на способности веществ светиться, при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресцентному излучению. Микроорганизмы, содержащие хлорофилл, витамин В12, некоторые антибиотики обладают первичной люминесценцией. Фазово-контрастная микроскопия используется для наблюдения за живыми клетками. Он основан на этом, что участки прозрачной клетки хоть мало, но отличаются друг от друга по плотности и светопреломлению. Проходя через них свет изменяют свою фазу. В оъектив фазово-контрастного микроскопа вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебания. При построение изображения взаимодействуют лучи, находящиеся в одной фаза или профазе, но обладающие разной амплитудой. В результате чего создается светло-темное контрастное изображение объекта. Интерференционная микроскопия. Принцип работы интерференционного микроскопа заключается в том, что пучок параллельных световых лучей разделяется на два потока: первый поток проходит через объект, приобретая изменения в фазе, а второй минует его. В призме они вновь соединяются и интерферируются между собой. В результате интерференции на изображение будут участки клетки разной толщины и плотности, которые будут отличаться друг от друга по степени контрастности. С помощью интерференционного микроскопа можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте. Лазерно конфокальная микроскопия. С помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа получают серию последовательных оптических срезов с разной глубины и изображение, которое накапливается в компьютере, и по специальной программе реконструируют трехмерное, объемное изображение. В основу положен метод флуоресценции, поэтом объекты должны быть окрашены флуохромами или обладать собственной флюоресценцией. 3.Электронная микроскопия. Методы изготовления микрообъектов для электронной микроскопии. Специальные методы изучения микрообъектов - гистохимия, радиография, иммуногистохимия. Методы исследования живых клеток – культуры вне- и внутри организма, клонирование, прижизненная окраска. Электронный микроскоп изобрели в 1832 году Эрнст Руско и Макс Кноль. Электронный микроскоп - это прибор для наблюдения и многократного фотографирования увеличенного изображения объекта, в котором вместо световых лучей используют пучки электронов, ускоренных до больных энергий в условиях глубокого вакуума. Электронная микроскопия может быть трансмиссионной (в проходящем пучке, подобно световой микроскопии) и сканирующей (снимающая рельеф поверхности). -срезы для электронного микроскопа используются однократно. -биологические объекты должны быть толщиной не более 0,1 мкм. 1.Взятие материала и его фиксация.Фиксация осуществляет в 2 стадии.Кусочки тканей фиксируются сначала в глутаральалдегиде, а затем четырехокисью осмия. 2. Уплотнение материала. Обезвоживаются в спиртах, и заливаться в пластмассы. Заливку производят в специальных формах путем, затвердение смеси происходит путем ее полимеризации в термостате, затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей. 3. Приготовление срезов. Блок, заключенный в пластмассу объектом крепится на приборе – ультрамикротоме. Площадь ультратонких срезов 0,1-1 мм2 4. Окрашивание или контрастирование срезов. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой необходимо дополнительно окрашивать с помощью солей тяжелых металлов (урана, свинца), которые связываясь с внутриклеточными структурами, дают положительное окрашивание. Изображение объектов получают на фотопластинках или на экране компьютера. Гистохимия - изучает локализацию различных веществ и продуктов их метаболизма в тканях. Гистохимическое окрашивание - это ряд приемов окрашивания направленных на выявление специфических химических веществ в клетках и тканях. Основные требования для реакций такого рода специфичность связывания красителя и неизменность локализации химических веществ. Например, реакция на ДНК, реакция Фельгена или ШИК-реакция на выявление в клетках гликогена и гликопротеинов. Радиография – этот метод позволяет изучать динамику синтетических процессов в клетки, а так же сравнивать их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов (водорода, углерода, фосфора) или меченных ими соединений. С помощью этого метода при использовании предшественников РНК было выявлено, что РНК синтезируется только в интерфазном ядре. В среду с находящимися там клетками вводятся предшественники макромолекул, один из атомов которых заменен изотопом. В процессе синтеза в биополимер включается меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место можно с помощью фотоэмульсии, которую потом проявляют - засвеченные участки это искомое вещество. Иммуногистохимия - метод основан на реакциях антиген - антитело. Каждая клетка имеет специфических антигенный состав, который определяется белками. Для усиления специфичности реакции применяют моноклональные антитела, образуемые линии клеток - клонами, полученных методом гибридом. Антитела можно использовать, как для изучения на световом, так и ультраструктурном уровнях с помощью электронного микроскопа. Метод позволяет с высокой точностью выявить функциональное состояние клеток, генетическую предрасположенность и трансформацию клеток при онкологических заболеваниях. Прижизненное исследование клеток в организме (in vivо) – Клетки окрашиваются витальными красителями - красители кислой (трипановый синий), основной (нейтральный красный, метиленовый синий) природы применяемые при очень высоком разведение, что оказывает минимальное влияние на жизнедеятельность клетки. В живых клетках красители собираются в цитоплазме в виде гранул, а в мертвых или поврежденных происходит диффузное окрашивание ядра и цитоплазмы. Суправитальное окрашивание клеток проводиться на изъятых клетках и тканях из организма. Выделяют молодые формы эритроцитов - ретикулоциты (краситель бриллиантовый крезиловый голубой) Исследование клеток в культуре (in vitro) – используют метод культивирования культур. Вырезанный кусок ткани обрабатывают раствором фермента трипсина, происходит разобщение клеток друг от друга, затем помешают в сосуд с питательной средой, где они сначала опускаются на дно, а потом начинают размножаться и образовывать сначала колонии, а затем клеточный пласт. Этот метод позволил выявить закономерности дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействия с микробами и вирусами. Клонирование- этот метод используется для искусственного получения копий клеток, молекул ДНК, органов и организмов. Генетическую однородность клеток усиливают клонированием из одной клетки при ее последовательном делении получают большую колонию клеток. Клон - это популяции клеток, происходящих и из одной клетки - предшественника. Клеточные гибриды. При слиянии двух клеток различных типов образуются гетерокарион - клетка с двумя ядрами. Для получения гетерокариона суспензию клетки обрабатывают этиленгликолем или инактивированным вирусом для повреждения плазмалеммы клеток, после чего клетки способны к слиянию. Гетерокарион способен кмитозу, в результате получается гибридная клетка. Оболочки ядер у гетерокариона разрушаются и их хромосомы объединяются в одно большое ядро. В результате клонирования гибридных клеток получают гибридные линии, которые используются для изучения генома. Гибридомы - клеточные гибриды, полученные при слияние нормальной антителообразующей клетки (В-лимфациты) и опухолевой клетки. Обладают способностью к синтезу моноклональных антител желаемой специфичности и неограниченному росту в искусственной среде, что обеспечивает гибридным клеткам своеобразное бессмертие. Технология гибридидом впервые была применена Г.Келером и С. Мильштейном в 1984 году. Моноклональные антитела имеют преимущество перед обычными сыворотками. Они служат идеальными по специфичность реагентами на определенные антитела. На основе гибридомных технологий развивается иммунотерапия. 4. Клеточные и тканевые технологии. Регенеративная медицина. Генная инженерия. В 1998 г. исследователям Университета штата Висконсин удалось получить культуру эмбриональных стволовых клеток человека, которые дифференцировались в нервные, мышечные и костные клетки, а также клетки островков поджелудочной железы. Клеточные технологии - совокупность методов, направленных на выделение отдельных типов клеток из какой-либо ткани, их культивирование (выращивание) с целью увеличения количества определенного типа клеток и последующего использования продуктов жизнедеятельности этих клеток или самих клеток в научных или научно-практических целях. Использование клеток, выделенных из различных органов и тканей человека, для лечения заболеваний получило название "регенераторная медицина". Регенеративная медицина — восстановление пораженной болезнью или повреждённой (травмированной) ткани с помощью активации эндогенных стволовых клеток или с помощью трансплантации клеток (клеточной терапии).В регенераторной медицине условно можно выделить два направления - клеточная и тканевая инженерия. Клеточная инженерия основывается на выделении определенных типов клеток, придании им in vitro с помощью генетических конструкций или "сигнальных" молекул специфических свойств и введения их в организм больного. Наиболее ярким примером клеточной инженерии является использование дендритных клеток для модуляции иммунного статуса и стволовых клеток как инструментов для генной терапии. Тканевая инженерия является самостоятельным междисциплинарным направлением. Эта форма терапии отличается от стандартной терапии тем, что сформированная инженерным путем ткань интегрируется в организм пациента, осуществляя постоянное и специфическое лечение болезни. При создании новой ткани используют один из трех общих подходов: 1. Дизайн и выращивание ткани человека in vitro с последующей ее имплантацией для восстановления или замещения поврежденных тканей. ( пересадка компонентов кожи при лечении ожогов) 2. Имплантация клеток, содержащих средства, индуцирующие репарацию или регенерацию функции поврежденных тканей. Этот подход основан на выделении клеток, добавлении к ним определенных "сигнальных" молекул, подобных факторам роста, и переносе этих клеток в биоматериалы, обеспечивающие регенерацию тканей. 3. Использование внутренних потенциалов тканей для восстановления функции поврежденных органов и тканей. Этот подход использует технику выделения стволовых клеток (СК), которые либо имплантируются пациенту непосредственно в суспензии или в структурном матриксе, либо после коммитирования in vitro. |