Микро. 1. Методы стерилизации. Методы контроля стерилизации. Стерилизация
 Скачать 75.42 Kb.
|
|
Строгие аэробы – размножаются только в присутствии кислорода (вибрионы, микробактерии) Микроаэрофилы – растут при сниженном по сравнению с аэробами парциальном давлении кислорода, но не растут без кислорода (некоторые виды бруцелл) Факультативные анаэробы – размножаются как в аэробных, так и в анаэробных условиях (большинство патогенных и условно-патогенных бактерий) Строгие анаэробы – размножаются только в бескислородных условиях (клостридии) 15. Культуральные свойства бактерий. Характер роста бактерий на жидких и плотных питательных средах. Культуральные свойства бактерий характеризуют их питательные потребности, условия и характер роста на твердых и питательных средах. Для роста и размножения бактерий важную роль играют температурные условия. В зависимости от температурного оптимума бактерии делят на 3 группы: психофилы, мезофилы, термофилы. Для выращивания микробов используют термостат. На жидких питательных средах бактерии могут образовывать следующие формы роста: Равномерное помутнение и осадок на дне – большинство патогенных бактерий; Пленку на поверхности среды – холерный вибрион, дифтерийные бактерии, туберкулеза; Пленку с отходящими в глубь среды нитями – возбудитель чумы; «Придонно-пристеночный» рост – стрептококки; Рост в виде «комочка ваты» - сибиеязвенная палочка. На плотных средах бактериальные клетки образуют колонии бактерий одного вида. Колонии разных видов отличаются по размерам, форме, поверхности, консистенции, окраске. Различают колонии R и S типа. S-типа – круглые, гладкие, блестящие, с ровными краями. R-типа – крупные, плоские, шероховатые, матовые с неровными краями. Большинство бактерий образуют колонии S-типа. R-типа образуют: возбудитель сибирское язвы, чумы, туберкулеза, дифтерии и микоплазмы. 16. Механизмы размножения бактерий. Скорость и фазы размножения. Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Выделяют следующие фазы размножения. 1. Лаг-фаза - период между посевом бактерий и началом размножения - когда бактерии не размножаются, а затем, по мере перестройки и приспособления, в течение 1—2 ч, начинают размножаться в нарастающем темпе; 2. Фаза логарифмического роста - периодом интенсивного деления бактерий; 3. Фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий; 4. фаза гибели бактерий. В идеальных условиях бактерия достигает состояния зрелости и размножается менее чем за 20–30 минут. 17. Методы выделения чистых культур аэробных бактерий. Этапы выделения. Чистая культура – популяция бактерий одного вида. В практических лабораториях обычно используется метод Дригальского - поверхностный последовательный рассев исследуемого материала петлей или шпателем на три чашки с МПА. 1 этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму. М     атериал захватывают петлей наносят на поверхность питательной среды. Культура в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. 2 этап. На следующий день посевы просматривают и изучают изолированные колонии, описывая характере роста. Также готовят мазок и изучают морфологию. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА. Помещают в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. 3 этап. На следующий день отмечают характер роста выделенной культуры. Чистая культура характеризуется однородным ростом. Кроме того используют метод Шукевича. Материал засевают в конденсационную воду МПА. Бактерии обладающие ползучим ростом из воды вползают на поверхность агара. На следующий день из верхнего края налета делают мазок и микроскопируют. Для выделения чистой культуры микробов, которые с трудом культивируются на питательных средах используют биологический метод – заражение наиболее восприимчивыхк данному виду возбудителя животных. 18. Методы выделения чистых культур анаэробных бактерий. Этапы выделения. Культивирование анаэробных бактерий производят в бескислородных условиях, которые можно создать в анаэростате и биологическим выделение методом Фортнера (чашку Петри с толстым слоем питательной среды делят пополам, на одну половину сеют культуру аэробу, на другую половину – анаэроба, чашку заливают парафином и кладут в термостат, сначала произойдет рост аэроба, потом анаэроба), Малкиной (используют 2 пробирки со скошенным МПА, соединенных трубкой, когда исчерпается кислород при росте аэроба, начинается рост анаэроба) и т.д. В практических лабораториях обычно выделения используют метод Цейсслера или Вейнберга. Метод Цейсслера. 1 этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму. Культуру засевают на среду Китта-Тароцци (МПБ+0,5% глюкозы + кусочек фарша или печени). Пробирки заливают слоем вазелинового масла или парафина, ставят в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. 2 этап. На следующий день посевы просматривают описывают характер роста. Также готовят мазок и микроскопируют. Производят пересев в чашки Петри на сахарно-кровяной агар для изучения изолированных колонии. Ставят в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. 3 этап. Просматривают посевы, изучают изолированные колонии и описывают характер роста. Для выделения и нкопления чистой культуры производят пересев на среду Китта-Тароцци. Ставят в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. 4 этап. Отмечают визуальный характер роста чистой культуры. Производят проверку чистоты, для чего ее микроскопируют. Метод Вейнберга. 1 этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму. Культуру засевают на среду Китта-Тароцци (МПБ+0,5% глюкозы + кусочек фарша или печени). Пробирки заливают слоем вазелинового масла или парафина, ставят в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. Затем проращенный материал последовательно разводят в пробирках с расплавленным и остуженным сахарным МПА. После чего переносят в 3-5 пстеровских пипетки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой. Ставят в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. 2 этап. Выросшие в узких пробирках колонии изучают с помощью лупы. На месте отобранной подозрительной колонии делают распил пробирки, колонию отбирают и пересеивают на среду КиттаТароцци. Ставят в термостат при температуре 37 оС на 24 часа. 3 этап. Через сутки проверяют чистоту выделенной культуры. 19. Методы культивирования анаэробов Культивирование анаэробных бактерий как спорообразующих (клостридии). так и неспорообразующих (вейлонеллы, бактероиды и др.) производят в анаэробных условиях. Анаэробные условия можно создать при культивировании в анаэростате. эксикаторе (на дно которого устанавливается зажженная свеча, либо наливается щелочной раствор пирагалола, поглощающий кислород) и биологическим методом по Фортнеру. Малкиной и т д. При посеве методом Фортнера чашку Петри с толстым слоем питательного агара делят пополам, вырезанной полоской. На одну половину агара сеют культуру аэроба, на другую - анаэроба. Чашку заливают парафином и помещают в термостат Сначала происходит рост аэробных бактерий Когда же они исчерпают из чашки весь кислород, начинается рост анаэробов. При посеве по методу Малкиной используют две пробирки со скошенным МПА. соединенных трубкой. В одну пробирку сеют культуру аэроба, в другую -анаэроба Когда исчерпается кислород при росте аэробных бактерий, начинается рост анаэробных Посевы анаэробов производят на среде Китта-Тароцци, состоящей из МПБ, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша. Перед посевом среду прогревают в водяной бане в течение 10-15 мин для удаления воздуха и остужают. После посева среду заливают слоем вазелинового масла или парафином с целью изоляции от атмосферного воздуха Выделение чистых культур анаэробных бактерий В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур анаэробов используются методы Цейсслера или Вейнберга. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов. Метод Цейсслера Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. При обнаружении подозрительных на анаэробы микробов исследуемый материал засевают на среду Китта-Тароцци. В случае необходимости предварительно исследуемый материал разводят стерильным 0,9% раствором NaCl. Пробирки заливают слоем вазелинового масла или парафина, подписывают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч. Второй этап. На следующий день посевы просматривают и описывают характер роста. Приготавливают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют, описывая морфологические и тинкториальные свойства бактерий. Затем производят пересев в чашки Петри на сахарно-кровяной агар, для получения изолированных колоний. Чашки помещают в анаэростат и термостатируют при температуре 37 °С 18-24 ч. Третий этап. Просматривают посевы, изучают изолированные колонии и описывают характер роста. Морфологию бактерий исследуют приготовлением мазка из колонии, окрашенного по методу Грама. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев подозрительной колонии в пробирку со средой Китта-Тароцци. Пробирки термостатируют 18-24 часа при температуре 37 °С. Четвертый этап. Отмечают визуальный характер роста чистой культуры Проводят проверку чистоты выделенной культуры, для чего ее микроскопируют (чистая культура морфологически и тинкториально однородна). Метод Вейнберга Первый этап проводят так же, как и при методе Цейсслера. Затем исследуемый материал, подращенный на среде Китта-Тароцци, последовательно разводят в пробирках с расплавленным и остуженным сахарным МПА. После чего его переносят в 3-5 пастеровских пипетки (трубки Виньяла). Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, при этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара. Пробирки термостатируют при температуре 37 °С 18-24 ч. Второй этап. Выросшие в узких пробирках колонии изучают с помощью лупы. На месте отобранной подозрительной колонии делают распил пробирки. колонию отбирают и пересевают на среду Китта-Тароцци. Пробирки культивируют в термостате 18-24 ч при температуре 37 °С. Третий этап. Через сутки проверяют чистоту выделенной культуры. 20. Биохимические свойства бактерий Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 классам. Ферментный состав любого микроба определяется его геномом и является довольно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий имеют важное таксономическое значение, широко применяясь для их систематики и идентификации. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств возбудителей, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека. Одни ферменты локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве бактерий - эндоферменты, другие - экзоферменты. выделяются в окружающую среду. Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений. Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последние носят название -мультиферментные комплексы (ферменты дыхательной цепи. локализованные на цитоплазматической мембране). У бактерий различают три основные группы ферментов: 1. Конститутивные - постоянно синтезирующиеся в микробных клетках. 2. Индуцибельные - синтез которых индуцируется соответствующим субстратом. 3. Репрессибельные - синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом. Для идентификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков, к которым относят: сахаролитические. протеолитические свойства бактерий, пигменто- и токсинообразование. Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов. 21. Ферменты бактерий. Методы изучения сахаролитических и протеолитических ферментов. Определение сахаролитических ферментов проводит на средах Гисса, состоящих из 1% пептонной воды. 0.5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NaOH). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет. Результаты посевов учитываются через 24-48 часов. О разложении углеводов судят по изменению цвета среды (она приобретает красный цвет, в результате сдвига рН в кислую сторону). О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке. Отдельные бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты - протеазы, катализирующие расщепление белка. Для определения протеолитических ферментов - коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ. На практике о протеолитической активности бактерий чаще судят по способности расщеплять белок до продуктов глубокого распада: индола и сероводорода. Для этого исследуемую культуры засевают на МПБ, между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород - индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н2S - она чернеет), а на индол - индикаторная бумага пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола - она краснеет). В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) или мультимикротесты (ММТ) СИБ - набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры ММТ - представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, на которые наносится взвесь изучаемой культуры. После суточного инкубирования в термостате по изменению цвета индикаторных дисков (при использовании СИБ) или содержимого лунок (при использовании ММТ) судят о биохимических свойствах культуры. Пигментообразование является стойким генетическим признаком микроба и его цвет используется для идентификации пигментообразующих бактерий. Для большинства патогенных бактерий пигментообразование не характерно. Белый. золотистый, лимонно-желтый пигмент образуют стафилококки, желтый, кремовый - микобактерии туберкулеза, рубиново-красный - серрации. сине-зеленый - синегнойная палочка. Пигменты, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовой радиации. 22. Микрофлора тела человека в различные возрастные периоды. В организме человека из микроорганизмов больше всего присутствуют бактерии.подавляющее большинство из них-сапрофиты-комменсалы(комменсализм- сотрапезничество,сапрофиты-едят мертвое).провести четкую границу между сапрофитами и патогенными микробами,входящими в состав нормальной микрофлоры,часто невозможно.попадание патогенного микроба в орган,чувствительный к его факторам патогенности,не всегда приводит к развитию заболевания.этот феномен связан с состоянием защитных факторов макроорганизма,не менее важно участие микрофлоры,конкурирующей с потенциальным возбудителем за пищевые и энергентические источники и препятствующей его колонизации. В течение внутриутробного периода организм развивается в стерильных условиях полости матки,и его первичное обсеменение происходит про прохождении через родовые пути и в первые сутки при контакте при контакте с окружающей средой.в случае рождения путем кесарева сечения состав микробов,колонизирующий организм новорожденного ,существенно иной. В норме многие ткани и органы здорового человека свободны от микроорганизмов, т.е. являются стерильными. К ним относятся: - внутренние органы, - головной и спинной мозг, - альвеолы легких, - внутреннее и среднее ухо, - кровь, лимфа, спинномозговая жидкость, - матка, почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре. Это обеспечивается наличием неспецифических клеточных и гуморальных факторов иммунитета, препятствующих проникновению микробов в эти ткани и органы. На всех открытых поверхностях и во всех открытых полостях формируется достаточно стойкая микрофлора, специфичная для данного органа, биотопа или его участка - эпитопа. Наиболее богаты микроорганизмами: - ротовая полость, - толстый кишечник, - верхние отделы дыхательной системы, - наружные отделы мочеполовой системы и кожа, Состав нормальной микрофлоры: • постоянная (резидентная) микрофлора представлена относительно стабильным составом микроорганизмов, обычно обнаруживаемых в определенных местах тела человека у людей определенного возраста; • транзиторная (временная) микрофлора попадает на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывая заболеваний и не обитая постоянно на поверхностях тела человека. Она представлена сапрофитными условно-патогенными микроорганизмами. Состав транзиторной микрофлоры может меняться в зависимости от: • возраста; • условий внешней среды, труда, рациона питания; • перенесенных заболеваний; • травм и стрессовых ситуаций. Полость рта Полость рта эмбриона обычно стерильна. Первичное инфицирование происходит при прохождении через родовые пути. Через 4-12 часов после родов полость рта колонизируют: - бифидобактерии; - кишечная палочка; - энтерококки; - зеленящие стрептококки (Streptococcus salivarius); - Staphylococcus epidermidis; - Corynebacterium pseudodiphtheriticum; - Candida albicans. Через несколько недель полость рта колонизируют: - анаэробные бактерии; - спирохеты; - лактобациллы (1 % от общего количества); - нейссерии (3-5 %). При прорезывании зубов – обильный рост анаэробов и появление простейших. С возрастом увеличивается содержание анаэробных бактерий, лактобацилл, стафилококков, кандид и простейших. Потеря зубов в пожилом возрасте приводит к значительному уменьшению содержанию облигатных анаэробов, интенсивной колонизации бактериями из ЖКТ. жкт ЖКТ новорождённого можно считать стерильным (12-16 часов после родов). В течение первой недели внеутробной жизни - интенсивная колонизация: - кишечными палочками; - энтерококками; - стафилококками; - бифидобактериями (преобладают); - спорообразующими анаэробами; - эшерихиями; К первому году жизни состав микрофлоры здорового ребенка практически идентичен микрофлоре здорового взрослого человека. кожа Первичная колонизация кожных покровов плода происходит при родах, но эта микрофлора (фактически флора родовых путей матери) в течение недели замещается следующими бактериями: - Staphylococcus epidermidis; - Micrococcus spр.; - Sarcina spp., - Аэробные и анаэробные дифтероиды; - Staphylococcus aureus; - гемолитические и негемолитические стрептококки. |