Микробиология. 1. отличия понятий контаминации и деконтаминации, дезинфекции и стерилизации, асептики и антисептики. Деконтаминация
 Скачать 1.85 Mb.
|
|
Состав. Среды делят на простые и сложные. К первым относят мясо- пептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.. Назначение: а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода; "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков − сыворотку крови, для возбудителя коклюша − кровь; в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды; д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды − глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий. Так, соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН. Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут; 12. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД. Стерилизуемый материал Метод стерилизации Режим стерилизации Примечание Натуральные питательные среды (почвенная вытяжка, картофельные и др.) натуральные среды Автоклавирование 1,5–2,0 атм; 30 мин В колбах, пробирках, бутылях и т. д., закрытых пробками Жидкие и агаризованные среды, не содержащие сахаров и других веществ, разлагающих при 120 °С Автоклавирование 0,5 атм; 15–30 мин Среды или компоненты сред , не выдерживающие нагревание (белки, некоторые витамины и аминокислоты) Автоклавирование ________ ________ Для стерилизации питательныих сред используют термический способ: стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте. При "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp автоклавировании 3–5 % жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5 % дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда будет иметь требуемую концентрацию. 13. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ. Выделение чистой культуры с последующей идентификацией. Изучению подвергаются жидкости, соскобы и др. 14. РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ. ПОНЯТИЕ И ВИДЫ ЦИТОКИНЕЗА. РОСТ БАКТЕРИЙ – упорядоченное увеличение количества и размеров всех компонентов клетки, что приводит к увеличению её массы. Рост всегда предшествует размножению. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние или цитокинезом. Процесс деления повторяется через приблизительно равные промежутки времени – от нескольких минут до нескольких часов – индивидуальная генетическая характеристика микробного вида. Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. В точке прикрепления хромосомы к цитоплазматической мембране (точке-репликаторе) действует белок- инициатор, который вызывает разрыв кольца хромосомы, и далее идет деспирализация ее нитей. Нити раскручиваются, и вторая нить прикрепляется к цитоплазматической мембране в точке- прорепликаторе, которая диаметрально противоположна точке-репликатору. За счет ДНК-полимераз по матрице каждой нити достраивается точная ее копия. Удвоение генетического материала – сигнал для удвоения числа органелл. В септальных мезосомах идет построение перегородки, делящей клетку пополам. Двухнитевая ДНК спирализуется, скручивается в кольцо в точке прикрепления к цитоплазматической мембране. Это является сигналом для расхождения клеток по септе. => Образуются две дочерние особи. На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток – колонии, различные по размерам, форме, поверхности, окраске и т.д. На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения или осадка. Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др. ВИДЫ ЦИТОКИНЕЗА: ð Изоморфный – при делении образуются две одинаковые клетки ð Гетероморфный – клетки делятся на две асимметричные половины; бактерии называются полиморфными. 15. КРИВАЯ РОСТА БАКТЕРИЙ В ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ. "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp Фазы размножение бактериальной клетки на жидкой питательной среде: 1) начальная стационарная фаза − то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится; 2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3–4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увели- чивается количество белка, РНК; 3) фаза логарифмического размножения - активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью; 4) максимальная стационарная фаза − бактерии достигают мак- симальной концентрации, т.е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит; 5) фаза ускоренной гибели − процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества. 16. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОНЯТИЙ: КОЛОНИЯ, КЛОН, ЧИСТАЯ КУЛЬТУРА, ВИД, ШТАММ. КОЛОНИЯ – это макроскопическое скопление бактериальных клеток, которые являются потомством одной бактериальной клетки [их размножение произошло на плотной питательной среде]. ð все клетки, входящие в состав одной колонии, принадлежат к одному виду. ð Колонии различаются по размеру, форме, строению, консистенции и цвету. ð Внешний вид колоний характерен для определенного вида бактерий. КЛОН – это культура, полученная заведомо из одной клетки [для научно-исследовательской работы, чаще всего – генетических исследований]. Для получения пользуются микроманипулятором. Это прибор, снабженный инструментами (иглами, пипетками) микроскопических размеров. С помощью держателя под контролем микроскопа их вводят в препарат "висячая капля" и нужную клетку (одну!) переносят в питательную среду. Она размножается и образует клон генетически идентичных клеток. ЧИСТАЯ КУЛЬТУРА – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде. ВИД – это эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих единый генотип, которая в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими признаками. ШТАММ – это разные микробные культуры одного вида, выделенные из различных источников или даже из одного и того же источника, но в разное время. Штаммы одного вида могут быть совершенно идентичными или различаться по отдельным признакам (устойчивость к антибиотику, ферментация какого-либо сахара и т.д.). Если возбудитель выделен из воды, говорят о водном штамме; из испражнений – фекальном штамме. Вирус гриппа, выделенный в Гонконге, получил название "штамм Гонконг", а в Сингапуре – "штамм Сингапур". Часто штаммы обозначают протокольными номерами. 17. ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРВОГО ЭТАПА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД *культуральный* – получение чистых культур микробов и изучение их биологических свойств, позволяющее провести идентификацию (т.е. определение вида микроба). "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp ПЕРВЫЙ ЭТАП БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ – «ПОСЕВ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА НА ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КОЛОНИЙ *скопления микробов одного вида, и, как правило, одного клона*» Проба, или мазок, берется со свободной поверхности среды или у пациента. Таким образом, мы получаем «коктейль» из множества видов бактерий, которые должны высеять на питательную среду. Иногда появляется возможность выделить сразу необходимые бактерии, зная их очаги распространения в организме. Далее мы посеваем на твёрдую питательную среду (среда выбирается, исходя из анамнеза). И, наконец, сам ПОСЕВ: • Газоном: чашка Петри, скошенный агар • Секторальный !!! Следует помнить, что при посевах и пересевах микробных культур внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил асептики для предупреждения контаминации питательных сред и предупреждения заражения окружающих и самозаражения !!! 18. МАКРОСКОПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЙ. ВНЕШНИЙ ВИД у некоторых бактерий настолько разнообразен, что служит их отличительным дифференциальным признаком. Например, колонии возбудителя сибирской язвы сравнивают с «гривой льва», чумы – с «кружевным платком», актиномицетов – с «зубом-моляром» и т.д. ПО ФОРМЕ: • Правильные – округлые; • Неправильные – амебовидные и ризоидные *переплетающиеся корни деревьев* В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДИАМЕТРА: точечные (< 1 мм), мелкие (1-2 мм), средние (2-4 мм) и крупные (4-6 и более мм). ЦВЕТ (в зависимости от пигмента) – белый, жёлтый, красный и т.д. • Стафилококк (белый, лимонно-жёлтый или золотистый) • Нейссерии и старцины (кремовый, жёлтый) исследуемый материал мазок окраска по граму микроскопирование "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp • Кишечные бактерии Serratia (красный) • Грибы Candida albicans (белый) • Грибы Candida glabrata (оранжевый) БОЛЬШИЕНСТВО ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ПИГМЕНТА НЕ ОБРАЗУЮТ – прозрачные или опалесцирующие. ПО КОНСИСТЕНЦИИ: мягкие, слизистые, плотные, крошковидные. ХАРАКТЕР КРАЯ определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением [ровные края – в виде четко выраженной линии; неровные – фестончатые или волнистые]. ПОВЕРХНОСТЬ: матовая или блестящая с глянцем; сухая или влажная, гладкая (S) или шероховатая (R). 19. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ ВЫРОСШИХ КОЛОНИЙ. Вернёмся к рисунку (вопрос 17) там: I сектор = n 2 II сектор = n 4 III сектор = n 6 IV сектор = n 8 Где n – количество мазка. Эмпирически установлено, что количество колоний между секторами будет отличаться в 100 раз. За n обычно воспринимается число 10 (т.к. концентрацию бактерий в материале обычно пересчитывают на 1 мл или 1 г). Измерение идёт в КОЕ (колониеобразующие единицы). Чтобы подсчитать количество выросших изолированных колоний на чашечке Петри в 4 секторе (где наблюдаем рост и определить общее количество жизнеспособных бактерий в 1 мл материала (КОЕ/мл), используем формулу: N = n * 10 K N – общее число бактерий n – число колоний в последнем секторе K – показатель степени 2, 4, 6, 8 для секторов 1, 2, 3, 4. 20. ЧТО ТАКОЕ «МИКРОБНОЕ ЧИСЛО» И «ОБСЕМЕНЕННОСТЬ» МАТЕРИАЛА? ПОНЯТИЕ О «КРИТИЧЕСКОМ ЧИСЛЕ». ОБЩЕЕ МИКРОБНОЕ ЧИСЛО (ОМЧ) – число всех микроорганизмов в 1 мл или в 1 г субстрата. !!! При этом учитывают, что чем больше микроорганизмов обнаружено во внешней среде, тем вероятнее загрязнение патогенными микроорганизмами. В связи с этим ОМЧ даёт представление об эпидемиологической обстановке !!! Методы определения ОМЧ: 1. Прямой подсчёт: в счётных камерах с помощью обычного или фазово-контрастного микроскопа. 2. Количественный посев: на плотные питательные среды. Микробным числом называют количество колоний, которые вырастают на мясопептонном агаре (МПА) при посеве 1 мл или 1 г субстрата и культивировании при 37°С в течение 24— 48 ч (или при 22°С 72 ч). ОБСЕМЕНЕННОСТЬ – наличие (количество) патогенной микрофлоры в воздухе, воде, пищевых продуктах и т.д. ЕЁ ВЫРАЖАЮТ В: • Титр — это наименьшее количество исследуемого субстрата, в котором обнаружен микроорганизм. • Индекс — количество клеток искомого микроорганизма, обнаруживаемого в определенном объеме исследуемого субстрата, например в 1000 мл воды, в 1 г почвы, в 1 г пищевых продуктов. КРИТИЧЕСКОЕ ЧИСЛО – это численность популяции обнаруженного в пораженном органе (кроме крови и ликвора) УПМ (условно-патогенная микрофлора), которое рассчитывают на 1 мл исследуемого материала. КЧ – показатель обсемененности, уровень которой может привести к воспалению и развитию инфекционного процесса. Обычно составляет 10 5 КОЕ/мл для экссудата из «закрытого» воспалительного очага и 10 6 —10 7 – для слизистой оболочки полости рта. "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp 21. ЧТО ВХОДИТ В ПОГНЯТИЕ «СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ»? Главными отличиями прокариотической (бактериальной) клетки от эукариотической является: отсутствие оформленного ядра (т.е. ядерной мембраны), отсутствие внутриклеточных мембран, ядрышек, комплекса Гольджи, лизосом, митохондрий. ОСНОВНЫМИ СТРУКТУРАМИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ ЯВЛЯЮТСЯ: Нуклеоид – представляет собой наследственный (генетический) материал бактериальной клетки, представлен 1 молекулой ДНК, замкнутой в кольцо и суперспирализованной (скручена в рыхлый клубок). Нуклеоид не отделен от цитоплазмы мембраной. Цитоплазма – коллоид, т.е. водный раствор белков, углеводов. Липидов, минеральных веществ, в котором находятся рибосомы, включения, плазмиды. На рибосомах происходит биосинтез белка. Рибосомы прокариот отличаются от эукариотических более мелкими размерами ( 70 S ). Включения – запасные питательные вещества бактериальной клетки, а также скопления пигментов: гранулы волютина (неорганического полифосфата), гликоген, гранулеза, крахмал, капли жира, скопления пигмента, серы, кальция. Включения, как правило, образуется при выращивании бактерий на богатых питательных средах и исчезает при голодании. Плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК, паразитирующие внутри бактриальной клетки. Кроме собственной генетической информации (F-плазмиды) плазмиды могут нести дополнительную генетическую информацию, полезную для бактериальной клетки. Клеточная мембрана – состоит из двойного слоя фосфолипидов и встроенных мембранных белков. КМ кроме барьерной и транспортной функций выполняют роль центра метаболической активности (в отличие от эукариотической клетки). Белки мембраны, ответственные за перенос необходимых веществ в клетку – пермеазы. На внутренней поверхности КМ находятся ферментные ансамбли, т.е.упорядоченные скопления молекул ферментов, ответственных за синтез энергоносителей – молекул АТФ. КМ может образовывать впячивания в цитоплазму, которые называют мезосомами. Существует два вида мезосом: • Септальные – образуют поперечные перегородки в процессе деления клетки. "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp • Латеральные – служат для увеличения поверхности КМ и повышения скорости обменных процессов. 22. ЧТО ТАКОЕ АУКСОТРОФЫ? ОСОБЕННОСТИ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ. АУКСОТРОФЫ – это микроорганизмы, характеризующиеся нарушением биосинтеза метаболита, без наличия которого они не способны расти на минимальных питательных средах, содержащих неорганические соединения в качестве источника азота и углеводы в качестве источника углерода. К ауксотрофам относятся также мутанты, нуждающиеся в различных факторах роста, не являющихся необходимыми для исходных штаммов так наз. дикого типа. Штаммы дикого типа, растущие на минимальных средах, называют прототрофами. Общепринятой классификации ауксотрофных микроорганизмов нет; тем не менее в зависимости от потребности в том или ином субстрате ауксотрофные микроорганизмы можно разделить на пять групп. К первой группе отнесены ауксотрофные микроорганизмы, нуждающиеся в какой-либо аминокислоте, |