Микробиология. 1. отличия понятий контаминации и деконтаминации, дезинфекции и стерилизации, асептики и антисептики. Деконтаминация
 Скачать 1.85 Mb.
|
|
ко второй — нуждающиеся в том или ином витамине, к третьей — нуждающиеся в азотистых основаниях, к четвертой — нуждающиеся в сочетании ряда аминокислот, витаминов или азотистых оснований или различных комбинаций их. Мутанты, требующие для своего роста несколько питательных веществ, носят название полиауксотрофных. В пятую группу включены ауксотрофные микроорганизмы, нуждающиеся в ростовых факторах и метаболитах, не относящихся к вышеуказанным веществам, например, в стрептомицине и др. Различают также ауксотрофные микроорганизмы с абсолютной (не растущие на минимальной среде) и относительной (медленно растущие на минимальной среде и быстро растущие в присутствии определенных метаболитов) потребностью. Отдельное положение занимают температурозависимые ауксотрофные микроорганизмы, которые в одних температурных условиях растут на минимальной среде, а в других требуют для роста дополнительных факторов. Поэтому при идентификации ауксотрофных микроорганизмов необходимо соблюдать стандартные условия опыта — состав среды и температуру выращивания. 23. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАТЕРИСТИКА ЧИСТЫХ КУЛЬТУР (второй этап бактериологического метода исследования). II ЭТАП – ИЗУЧЕНИЕ ВЫРОСШИХ КОЛОНИЙ (микроскопическое или макроскопическое) И ПОСЕВ НА СКОШЕННЫЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АГАР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ. Просматривают чашки и отмечают оптимальную питательную среду, скорость роста, характер роста микроорганизмов. Для изучения выбирают изолированные колонии, расположенные по ходу штриха, ближе к центру. Если вырастает несколько типов колоний – каждый исследуется в отдельности. Накопление чистой культуры. Для накопления чистой культуры изолированные колонии всех морфотипов пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой и инкубируют в термостате при +370С (такая температура оптимальна для большинства микроорганизмов). 24. СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ (третий этап). ПРИЗНАКИ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИЗНАКОВ Морфологические размеры форма взаимное расположение тинкториальные свойства: окраска по Граму или другими дифференциально- диагностическими методами Культуральные рост на плотных (вид колоний) и в жидких средах Биохимические выявление ферментов: протеаз (разлагающих белки) карбогидраз (разлагающих углеводы) липаз (разлагающих липиды) оксидоредуктаз (оксидазы, каталазы, дегидраз) ферментов-токсинов(гемолизинов, плазмокоагулазы, лецитиназы, гиалуронидазы,ДНК-азы) экзотоксинов (дифтерийного и др.) профиля летучих жирных кислот (для анаэробов) "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp Генетические содержание Г+Ц (%) в ДНК последовательность нуклеотидов в ДНК и РНК Серологические изучение антигенной структуры микроба и определение его серовара в РА на стекле с моновалентными сыворотками или в реакции латекс-агглютинации Биологические вирулентность для животных токсигенность чувствительность к бактериофагам (определение фаговара) чувствительность к антибиотикам Экологические (естественное место обитания) + тест на чувствительность к антибиотикам. Учитывают результаты изучения биохимических, серологических, генетических и др. характеристик и сравнивают их со свойствами эталонных (типовых) штаммов различных видов микроорганизмов => относят идентифицируемый микроорганизм к тому виду, с которым он проявляет наибольшее сходство => учитывают спектр чувствительности к противомикробным препаратам. => выдают заключение. 25. ОСНОВНЫЕ ГРУППЫ ФЕРМЕНТОВ БАКТЕРИЙ. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ И ГЛИКОЛИТИЧЕСКИЕ, КОНСТИТУТИВНЫЕ И ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ: ИХ ЗНАЧЕНИЕ, СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НА ПРАКТИКЕ. ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ, ИМЕЮЩИЕ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ. В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: • Оксидоредуктазы – катализируют реакции окисления-восстановления. • Трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору. • Гидролазы – катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды. • Лиазы – катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления. • Изомеразы – катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки). • Лигазы (синтетазы) – катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки — эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты. В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на: • Конститутивные – ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. [Например, ферменты гликолиза]. • Индуцибельные – ферменты, которые синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соответствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. [К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов]. Известны также ферменты, которые получили название аллостерических. Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению (стерически) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций. Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткани и клетки макроорганизма , обуславливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в инфицированных тканях [плазмокоагулаза, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа, гиалуронидаза]. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий. Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза. Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы: • гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых являются различные сахара, а продуктами их расщепления - кислоты, спирты, альдегиды, Н2О и СО2; • протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образованием полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода. 26. СЕЛЕКТИВНЫЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ, ИХ ЦЕЛЕВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ. СЕЛЕКТИВНЫЕ СРЕДЫ Селективные среды содержат вещества, утилизируемые определенным микробом. Данные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. МОЛОЧНО-СОЛЕВОЙ АГАР: питательный агар для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г; или питательный агар (на основе гидролизата кормовых дрожжей) – 24,0 г; натрий хлористый (NaCl) – 75,0 г; молоко обезжиренное – 100 см 3 ; вода дистиллированная – 1 дм 3 ЖЕЛТОЧНО-СОЛЕВОЙ АГАР: 1 л мясо-пептонного бульона, 95 г хлористого натрия и 100 мл яично-желточной эмульсии (куриный желток). ДИФФРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ – позволяют отличить один вид микроба от другого на основании разной биохимической активности бактерий. ДИФФРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ ОБЪЕДИНЕНЫ ПО СОСТАВУ: "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp • Питательная среда – обеспечивает размножение бактерий; • Какой либо субстрат – отношение к которому является диагностическим признаком; • Индикатор – изменение которого свидетельствует о расщеплении субстрата и образовании конечных продуктов. СРЕДЫ ГИССА (пёстрый ряд) – набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам. СРЕДА ЭНДО – плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными. СРЕДА ЛЕВИНА (лактозоэозинметиленовый агар) – среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет , колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды ( светло-фиолетового цвета ). СРЕДА ПЛОСКИРЕВА – плотная питательная среда, содержащая соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. [смешанная среда, так как является ещё и селективной]. СРЕДА РЕССЕЛЯ. Состав: МПА, глюкоза, лактоза, манит, сахароза, индикатор бромтимоловый синий (в нейтральной среде – сине-зеленого цвета, при сдвиге рН в кислую сторону становится желтым). При газообразовании в среде появляются пузырьки газа. Состоит из 2-х пробирок со скошенной средой. СРЕДА РОТБЕРГЕРА. Для приготовления: 10 мл расплавленного питательного агара добавляют 3—4 капли насыщенного родного р-ра нейтрального красного; стерилизуют дробно; пробирки со средой охлаждают в вертикальном положении. Использование Р. с. основано на способности различных бактерий в процессе метаболизма выделять в среду редуцирующие вещества, которые вступают в реакцию с рядом красителей и обесцвечивают их. Утратила свое практическое значение в результате применения более совершенных дифференциально-диагностических сред. ХРОМОГЕННЫЕ СРЕДЫ – позволяют выявить специфические ферментативные активности для разных микроорганизмов. Идентификация микроорганизмов возможна уже на этапе первичного посева, в результате происходит сокращение времени исследования и получаем ускоренный результат! Принцип действия. Хромогенные среды включают хромогенные (флюорогенные) субстраты для выявления специфических ферментативных активностей микроорганизмов. Исследуемый микроорганизм содержит фермент, который метаболизирует бесцветный хромогенный субстрат, образуя окрашенный продукт реакции. Хромогенная среда контрастно изменяет свой цвет (или флюоресцирует) при обнаружении исследуемого микроорганизма. Нет необходимости в проведении пересевов и постановке дальнейших биохимических тестов для идентификации микроорганизмов. ДДС способны: • Расщеплять белки; • Расщеплять углеводы и спирты; • Обесцвечивать красители; • Усваивать определенные вещества. 27. ДЫХАТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ. ЕГО ХАРАКТЕРИСТИКА. Дыхательный метаболизм – источник легко доступной энергии для использования её во многих метаболических процессах. Дыхание может протекать с участием молекулярного кислорода в качестве терминального акцептора электронов – аэробное дыхание. В тех случаях, когда акцептором являются сульфаты, нитраты, карбонаты – анаэробное дыхание. В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H2O2- перекись водорода, -О2 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют , также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH2). 28. ТИПЫ ДЫХАНИЯ БАКТЕРИЙ. МИКРОАЭРОФИЛЫ. По типу дыхания выделяют: 1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания [в основном собираются в верхней части протирки, чтобы приглашать максимальное количество кислорода]. 2. Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO2, например до 10- процентной концентрации. 3. Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание [энтеробактерии]. 4. Облигатные (строгие) анаэробы – способны существовать только в отсутствии свободного кислорода; дыхание происходит путём ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии [клостридии столбняка, ботулизма]. 5. Капнофилы [возбудители бруцеллеза, стрептококки полости рта] нуждаются в избыточном количестве углекислого газа (до 20%). 29. БРОЖЕНИЕ. ПРИМЕРЫ. БРОЖЖЕНИЕ (субстратное фосфорилирование) – разновидность анаэробного дыхания, при котором и донором и акцептором водорода является органическое вещество. При брожении происходит расщепление сложных органических веществ до более просто устроенных с выделением небольшого количества энергии. При поступлении глюкозы в клетку, происходит гликолиз и образуется ПВК. Дальнейшие ее превращения зависят от набора ферментов анаэробных бактерий. В зависимости от того какие конечные продукты образуются, выделяют разные типы брожения: • Молочнокислое брожение вызывается лактобактериями, бифидобактериями, стрептококками, образуя из ПВК молочную кислоту (гомоферментативное брожение) или янтарную, уксусную кислоты, ацетон (гетероферментативное брожение). Эти бактерии применяются в производстве молочно-кислых продуктов: ряженки, простокваши, кефира, йогуртов и творога. • Маслянокислое брожение. Возбудителями этого вида брожения являются анаэробные бактерии рода клостридии, а также бактероиды, фузобактерии и другие микроорганизмы, вызывающие у человека опасные анаэробные инфекции. Основным продуктом брожения является масляная, изомасляная, уксусная, валериановая кислоты • Пропионовокислое брожение также вызывается анаэробами - пропионибактериями (обитатели кожи и слизистой оболочки человека и животных могут вызывать анаэробные инфекции), которые используются в производстве сыров. Конечный продукт брожения - пропионовая кислота • Спиртовое брожение. Вызывают дрожжи. В результате спиртового брожения образуется этиловый спирт , что издавна используется в пивоварении и виноделии. • Бутиленгликолевое брожение. В результате брожения образуются бутиловый спирт, этиленгликоль, срероводород и другие токсические продукты . Этот вид брожения вызывают кишечная палочка и другие энтеробактерии, в том числе - возбудители кишечных инфекций - сальмонеллёза, дизентерии. При субстратном фосфорилировании из глюкозы или других источников углерода выделяется незначительное количество энергии, так как образующиеся при этом продукты брожения (молочная кислота, спирты и др.) сохраняют в себе значительные количества энергии. Поэтому в анаэробных условиях бактериальная культура для получения необходимой энергии во много раз больше разлагает пищевого материала, чем в присутствии кислорода. Теплообразование "HELPER" - https://vk.com/fastmedhelp при развитии бактериальной флоры в органическом материале (навоз, торф, мусор) может привести к его самовозгоранию . 30. СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ. АНАЭРОБЫ ПОЛОСТИ РТА. КЛАССИФИКАЦИЯ И ПРИМЕРЫ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ. Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением следующих методов. Физические методы. Они основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде с использованием анаэростата. • Газогенерирующий пакет «ГазПак» - Для создания необходимой атмосферы в анаэростате используют газогенирирующие пакеты. |