МИКРА ЭКЗ 2019. 1. Предмет и задачи микробиологии
 Скачать 471.08 Kb.
|
|
13. Препарат «раздавленная» капля из плесени. Значение. В каплю воды на предметном стекле внести кусочек мицелия или тело гриба, тщательно расщепить его и накрыть покровным стеклом. Микроскопировать сухой иммерсионной системой. Обратите внимание на строение мицелия, органов плодоношения. Значение.Для микроскопии живых микроорганизмов, наблюдении за подвижностью и формами, а также для определения количества клеток. 14.Препарат «толстая» капля из крови. Значение. На предметное стекло нанести две капли крови, которые равномерно нужно распределить в виде пятна с 10- коппечную монету. Нефиксированный препарат окрасить по Романовскому-Гимзе. Краска Романовского-Гимза состоит из азура, эозина, метиленового синего. Цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядро в красно-фиолетовый. Перед окраской 20 капель краски добавить к 10 мл дистиллированной воды и налить ее на препарат на 30-40 минут, после чего краску слить, препарат промыть водой, микроскопировать. Значение. Выявление простейших. 15. Темнопольная микроскопия спирохет. С помощью осветителя и его диафрагмы равномерно освещают зеркало микроскопа и его вращением добиваются появления на верхней линзе конденсора освещенного кольца. На поверхность конденсора наносят каплю дистиллированной воды, препарат раздавленная капля кладут на столик микроскопа и конденсор поднимают до соприкосновения с предметным стеклом. Устанавливают большой сухой объектив, находят объект, с помощью зеркала достигают максимального освещения поле зрения, после чего добиваются резкости изображения. На темном фоне видны спирохеты в виде тонких, блестящих, спиралевидно закрученных нитей. 16. Правило приготовления питательных сред( МПБ, МПА) 1. Приготовить питательный мясо – пептонный бульон, для чего в колбу со 100 мл дистиллированной воды поместить навеску пасты, содержащей концентрированный рыбный гидролизат, размешать, кипятить в течение 2 – 3 минут, определить рН (7,2 – 7,5), профильтровать, разлить в пробирки и простерилизовать в автоклаве. 2. Приготовить питательную среду из сухого агара, для чего всыпать в колбу со 100 мл дистиллированной воды навеску сухого порошка, размешать, кипятить на слабом огне 1 – 2 минуты, профильтровать, разлить по пробиркам. После автоклавирования пробирки оставить на столе в наклонном положении для застывания агара в виде скошенной поверхности (скошенный агар). 17. Стерилизация питательных сред и лабораторной посуды. Стерилизацией называют полное уничтожение вегетативных клеток микроорганизмов и их спор в каком – либо материале (питательной среде, посуде, приборе, инструменте, перевязочном материале и т.д.). Выбор способа стерилизации зависит от свойств стерилизуемого объекта. Физический способ 1. Прокаливание на огне: в пламени горелки или спиртовкиобычно стерилизуют петли и иглы для посева, предметные стекла, инструмент. 2. Кипячение – в течение 30 мин: обычно кипятят шприцы, иглы,пищевые продукты и др. При этом могут сохраняться споры бактерий. 3. Стерилизация сухим жаром (сухожаровая) – в специальном сушильном шкафу, как правило, стерилизуют хорошо вымытую посуду:колбы, пробирки и др.; обычно каждый предмет завертывают в пергаментную бумагу. При температуре 160–170 °С погибают не только все микроорганизмы, но и их споры. 4. Стерилизация паром проводится при температуре 100–120 °С, так как во влажной атмосфере микроорганизмы погибают быстрее при более низкой температуре.Существует два способа стерилизации паром: а) стерилизация насыщенным паром под давлением Данный способ стерилизации питательных сред является наиболеенадежным и чаще всего приемлемым. Он основан на нагревании мате- риала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает особуюэффективность этого процесса (Обычно автоклавирование осуществляется при температуре 121 °С(1 атм) в течении 15–30 мин, при этом погибают и вегетативные клеткиспоры микроорганизмов). Этот способ не приемлем для тех сред, которые содержат в своем составе белки или другие вещества, разрушающиеся при высокой температуре; б) стерилизация текучим паром (тиндализация) Тиндализация, стерилизация текучим паром применяется для сред, портящихся при действии температур выше 100 °С. Тиндализациюосуществляют текучим паром в автоклаве с завинченной крышкой или вкипятильнике Коха. Среды нагревают несколько раз по 10–15 мин.Между прогреванием среды ставят в термостат при температуре 30 °С на 8–12 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревание при 100 °С, прогревают более осторожно: при 60–80°С через каждые 8–12 ч 4–5 суток подряд. 5) Пастеризация – метод, применяемый для уничтожения неспороносных бактерий в питательных средах (вине, молоке, соке, пиве идр.), теряющих свои качества при кипячении. Пастеризуют среды в течение 15–30 мин. при температуре 50–60 °С или в течение 5–10 мин.при температуре 70–80 °С в водяной бане или термостатах. 6. стерилизация УФ-лучами ведется с применением кварцевых ламп, которые пропускают УФ-лучи. Питательные среды и другиепредметы помещают на расстоянии 20–30 см от источника света на20 мин. При этом воздействии погибают микроорганизмы, но остаются живыми их споры. Конкретно стерилизация различных сред описана в специальных источниках, справочниках. Механический способ а) стерилизация фильтрованием – применяется для жидкостей, не выдерживающих нагревания. Для этого используют мелкопористыефильтры, в последнее время распространены мембранные (задержива-ющие бактерии и их споры и даже вирусов и бактериофагов). Передфильтрованием фильтры стерилизуют кипячением. Само фильтрованиеведется под вакуумом; Химический способ Химическая стерилизация проводится с помощью веществ, обладающих антимикробным действием. В качестве стерилизантов в настоящее время используют растворы карболовой кислоты или фенола (3 – 5 %), сулемы (0,1 – 0,2%), хлорамина (1 – 5 %), этиловый спирт, щелочи и кислоты различной концентрации. 18. Техника выделения чистых культур Выделение чистых культур бактерий состоит из 3 – х этапов: • посев исследуемого материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний; • исследование колоний; • пересев с выбранных колоний на скошенный в пробирке МПА или специальную среду. А)Техника посева на чашки Петри бактериологической петлей Петлю исследуемого материала наносят на агар около края чашки и растирают на небольшом участке,затем, не отрывая петли, засевают материал на всю поверхность среды параллельными штрихами с интервалом 4 – 5 мм. Посев можно производить и следующим способом: делается 4 – 5 параллельныхштрихов в направлении А, затем петля прожигается в пламени горелки и ею проводятся штрихи внаправлении Б поперек первоначально нанесенных полос. Петля снова прожигается, и делаются штрихи внаправлении В, а затем и в направлении Г . Б) Техника посева шпателем (метод Дригальского) Берут 3 чашки Петри с плотной питательной средой. На середину первой петлей или пастеровской пипеткой вносят каплю исследуемого материала и круговыми движениями шпателя производят сплошной посев. Этим же шпателем, не стерилизуя его, распределяют материал по второй и третьей чашкам. В) Техника посева тампоном ( по Линцею) Первоначально тампоном, поворачивая его разными сторонами, проводят на чашке со средой диагональную дорожку шириной 1 – 2 см, затем штрихами петли через дорожку засевают среду по обе её стороны.Во втором варианте один из радиальных секторов чашки засевают тампоном,а затем поочередно остальные секторы – петлей с заходом каждый раз на уже обработанную тампоном поверхность. Г) Метод мазков-отпечатков. Свежий срез объекта (например, кусочков органов, пищевых продуктов плотной консистенции) берут пинцетом и прикасаются к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри. Получив изолированные колонии, из колоний с различной характеристикой или содержащих различные по форме и окраске бактерии делают пересев бактерий 19.Описание выросших колоний. После инкубации изучают изолированные колонии. Колонии обладают набором определенных признаков:а) размеры – большие (диаметр более 4 – 5 мм), средние (диаметр 2 – 4 мм), мелкие (диаметр менее 1 – 2 мм) и микроскопические (диаметр менее 1 мм);б) цвет – белый, жёлтый, сине – зелёный, бурый, чёрный, цвет среды и др.;в) форму – круглая, лаптеобразная, розеткообразная и др.;г) края – ровные, волнистые, зазубренные, отростчатые и др.;д) поверхность – гладкая, шероховатая, блестящая, матовая, плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная и др.;е) консистенция – сухая, пастообразная, слизистая, однородная, зернистая;ж) прозрачность – прозрачная, мутная. Для определения морфологии клетки и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму. Оставшуюся часть колонии отсевают на скошенный питательный агар. 20.Техника пересева. Техника посева проб в пробирки со скошенной средой. Обычно на скошенные среды переносят культуру с колоний на чашках. Для этого необходимо приподнять крышку чашки Петри и стерильной петлёй прикоснуться к колонии. После этого в левую руку берут пробирку со скошенным агаром (между большим и указательными пальцами) так, чтобы поверхность скошенного агара была перед глазами. Пробирку открывают над пламенем горелки, обжигают её край, а затем петлю вводят в пробирку до дна, где имеется небольшое количество конденсационной воды. Плоской поверхностью петли прикасаются к поверхности агара и делают посев штрихообразными движениями, постепенно продвигаясь снизу вверх. Обжигают в пламени край пробирки и пробку, закрывают пробирку над пламенем. Техника_посева_в_жидкую_среду: простерилизованной бактериологической петлей отбирают материал, наносят его на стенку пробирки у верхнего уровня среды и, слегка встряхивая пробирку, смывают его средой. Край пробирки и пробку обжигают, быстро закрывают. В пробирку с плотной питательной средой методом «укола»: осуществляется уколом, микробиологической петлёй или иглой в столбик плотной или полужидкой питательной среды. Применяется для выращивания анаэробов, для выявления характера роста по ходу укола и для определения газообразования. У подвижных и неподвижных микроорганизмов характер роста будет различным. Посев уколом практикуют также для длительного хранения культур. Используют высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, полускошенные плотные среды. Во всех случаях бактериальной петлей или иглой с посевным материалом делают прокол среды с поверхности до дна. Пробирку рекомендуют держать дном вверх, чтобы не наступила контаминация среды воздушной микрофлорой. 21. Определение протеолитических свойств бактерий. Протеолитическая активность бактерий определяется их способностью разжижать желатину, свернутую сыворотку крови, образовывать при расщеплении белков индол, сероводород, аммиак. 1) Выделение индола: засеять чистую культуру в пробирку с мясо – пептонным бульоном для определения протеолитических свойств бактерий. Под пробку пробирки поместить индикаторные бумажки для выявления индола. Обнаружение индола производится при помощи фильтровальной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты, высушенной и разрезанной на узкие полоски. В случае образования индола бумажка окрашивается в розовый цвет. 2) Выделение сероводорода: засеять чистую культуру в пробирку с мясо – пептонным бульоном для определения протеолитических свойств бактерий. Под пробку пробирки поместить индикаторные бумажки для выявления сероводорода. При наличии сероводорода бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца, чернеет. 3) Выделение аммиака: с целью выявления аммиака применяют лакмусовую бумажку, которая в положительном случае синеет. 22. Определение сахаролитических свойств бактерий («пестрый ряд» Гисса). Сахаролитические свойства бактерий выявляются в способности ферментировать углеводы с образованием различных кислых продуктов и газообразных веществ. Для этого используют короткий и длинный «пёстрый» ряд. Первый включает в себя среды Гиса с моно – дисахаридами (глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой) и с шестиатомным спиртом – маннитом. В длинный «пёстрый» ряд вводят дополнительно среды с моносахаридами, полисахаридами и спиртами. В качестве индикатора во все среды добавляют реактив Андраде (щелочной раствор кислого фуксина). Чистую культуру исследуемых бактерий засевают на среды «пёстрого» ряда. Если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Засеять исследуемую культуру на среды «пёстрого» ряда: с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом. Посев следует произвести уколом в столбик полужидкого агара, содержащего углевод и индикатор, затем инкубировать при 370С в течение 18 – 24 часов. 23. Определение каталазной активности бактерий. Антиоксидантная активность бактерий заключается в способности разлагать активные формы кислорода, секретируемые активированными макрофагами. Основную роль играют: фермент каталаза – разлагающая перекись водорода и супероксиддисмутаза – разрушающая супероксиданион радикал. Определить наличие у бактерий каталазы, для чего на предметное стекло нанести каплю 3 % раствора Н2О2 и внести в неё петлю бактериальной культуры. Каталаза разлагает Н2О2 на воду и кислород. Выделение пузырьков кислорода свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы. 2 ТОЧКА 1. Влияние физических факторов на микроорганизмы Влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы: Бактерицидное – приводящее к гибели клеток Бактериостатическое – подавляющее размножение микроорганизмов Мутагенное – изменяющее наследственные свойства микроорганизмов Физические факторы: температура, давление, высушивание, излучение Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при высокой — термофилами. К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий. Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С. При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250—300 °С и давлении 262 атм. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы. Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С). Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты. Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств. Действие излучения. Неионизирующее излучение — ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм. Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора. 2.Влияние химических факторов на микроорганизмы. Применение химических веществ основа метода антисептики. Эффективность зависит от концентрации химических веществ и времени контакта с микробом. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост, проявляя статический эффект , либо вызывать их гибель микробицидный эффект .Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д. Дезинфеканты- это н химические вещества неспецифического действия, применяемы для обработки помещений, оборудования и различных предметов. В рабочих концентрациях оказывают бактерицидное действие. Антисептики вещества используемые для обработки живых тканей. Оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие. |