МИКРА ЭКЗ 2019. 1. Предмет и задачи микробиологии
 Скачать 471.08 Kb.
|
|
28. Патогенность. Вирулентность. Методы количественного выражения вирулентности Патогенность микроба- его потенциальная способность вызывать инфекционный процесс. По этому признаку все существующие микроорганизмы подразделяют на патогенные, условно-патогенные и сапрофиты. Вирулентность— это степень патогенного действия конкретного микроорганизма. Микроорганизм считается вирулентным, если он при внедрении в огранизм, даже в исключительно малых дозах, приводит к развитию инфекционного процесса. Количественное определение вирулентности DLm-минимальная смертельная доза DcL-безусловно смертельная доза DL50-доза, вызывающая гибель 50% зараженных животных 29. Факторы вирулентности: адгезины, инвазины, токсины. Факторы персистенции АДГЕЗИНЫ – с помощью которых бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и колонизируют клетки (например, фимбрии, белки наружной мембраны, ЛПС) ИНВАЗИНЫ – ферменты, с помощью которых бактерии проникают в ткани (например, гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту, нейраминидаза – расщепляет сиаловые кислоты, лецитиназа – расщепляет лецитин, фосфатаза – расщепляет фосфолипиды) ЭНДОТОКСИНЫ Характерны только для гр«–» бактерий Представлены ЛПС и связанными с ними белками Термостабильны Высвобождаются из бактериальной клетки после их разрушения Не обладают специфичностью действия, т.е. вызывают неспецифические клинические симптомы ЭКЗОТОКСИНЫ Продуцируют гр«+» и гр«–» бактерии Белки Термолабильные Обладают высокой избирательностью и специфичностью действия, т.е. вызывают специфические клинические симптомы По молекулярной организации различают 2 группы: 1) двухфрагментные – А и В 2) «разрезанные токсины» (протоксины) Факторы персистенции Группа факторов, обеспечивающих микроорганизму устойчивость к иммунитету и неспецифическим факторам защиты Наиболее выражены у возбудителей вялотекущих, хронических и генерализованных инфекций Примеры факторов персистенции: Морфологические структуры - капсула, слизистый чехол Ферменты, противостоящие кислороднезависимым механизмам фагоцитоза: АЛА, АКА, АИА Антиоксидантные ферменты – каталаза, СОД Поверхностные белки, подавляющие фагоцитоз: белок А, белок М, Vi-Аг 30. Основные источники инфекции и способы заражения человека Источники инфекции Человек Животные Объекты окружающей среды По источнику различают: антропонозные зооантропонозные и сапронозные инфекции Способы и пути передачи Воздушно-капельный Воздушно-пылевой Фекально-оральный Трансмиссивный Половой Контактный Парентеральный Трансплацентарный 31. Распространение возбудителей и их токсинов в организме Контактный путь (от клетки к клетке) Лимфогенный или гематогенный путь По нервным путям Судьба патогенных микробов, попавших в организм, может быть различной, в зависимости от состояния организма и вирулентности возбудителя. Некоторые микробы, попав с током крови в определённые органы, оседают в их тканях, размножаются в их тканях, выделяют токсины и вызывают заболевания. Любая инфекционная болезнь, независимо от клинических признаков и локализации микроба в организме, представляет собой заболевание всего организма. Если патогенные микробы проникли в кровяное русло и быстро начинают размножаться, за короткое время они заполняют все внутренние органы и ткани. Такую форму инфекции называют септицемией. Когда микробы находятся в крови временно и не размножаются в ней, а посредством её лишь переносятся в другие органы и ткани, где в последствии размножаются, инфекцию принято называть бактериемией. Иногда микробы, проникнув в организм, остаются только в повреждённой ткани и, размножаясь, выделяют токсины, которые вызывают тяжелое отравление. Такой процесс называется токсемией. ПОНЯТИЯ, КОТОРЫЕ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ И ИХ ТОКСИНОВ ЧЕРЕЗ КРОВЬ Бактериемия – наличие в циркулирующей крови бактерий Вирусемия – наличие в циркулирующей крови вирусов Сепсис – тяжёлое генерализованное лихорадочное заболевание, при котором возбудитель размножается в кровеносной системе 32. Характеристика форм манифестной инфекции Типичная – возбудитель проникает в организм, активно размножается и вызывает характерные для данной болезни клинические проявления Атипичная – возбудитель проникает, активно размножается в организме, который отвечает иммунобиологическими реакциями, но клинические симптомы болезни носят стёртый или атипичный характер Медленные инфекции – характеризуются длительным инкубационным периодом, длительным прогрессирующим развитием болезни, слабым иммунным ответом и тяжёлым исходом Хроническая (персистентная) – возбудитель проникает в организм, размножается в нём. Вызывает активную форму болезни, но под влиянием иммунных систем организма и химиопрепаратов подвергается L-трансформации. Возвращаясь в исходную форму, возбудитель восстанавливает патогенные свойства, размножается и вызывает рецидив болезни 33. Характеристика форм бессимптомной инфекции Абортивная – возбудитель проникает в организм, но не размножается в нём (причины: высокая неспецифическая резистентность или приобретённый иммунитет) Латентная – возбудитель проникает в организм, размножается, организм отвечает иммунными реакциями и элиминирует микроб, клинических проявлений нет Дремлющая инфекция - бессимптомное пребывание возбудителя в организме может сохраняться долгое время после латентной инфекции или после перенесенного заболевания. Под влиянием условий, понижающих сопротивляемость организма, микроорганизмы активизируются и вызывают заболевание или его рецидив Бактерионосительство (вирусоносительство) - наличие патогенных микробов, как правило, после перенесенного заболевания, клинических проявлений нет Навыки. 1.Определение протеолитических ферментов. Протеолитическая активность бактерий определяется их способностью разжижать желатину, свернутую сыворотку крови, образовывать при расщеплении белков индол, сероводород, аммиак. 1) Выделение индола: засеять чистую культуру в пробирку с мясо – пептонным бульоном для определения протеолитических свойств бактерий. Под пробку пробирки поместить индикаторные бумажки для выявления индола. Обнаружение индола производится при помощи фильтровальной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты, высушенной и разрезанной на узкие полоски. В случае образования индола бумажка окрашивается в розовый цвет. 2) Выделение сероводорода: засеять чистую культуру в пробирку с мясо – пептонным бульоном для определения протеолитических свойств бактерий. Под пробку пробирки поместить индикаторные бумажки для выявления сероводорода. При наличии сероводорода бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца, чернеет. 3) Выделение аммиака: с целью выявления аммиака применяют лакмусовую бумажку, которая в положительном случае синеет. 2. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам: А. Метод дисков. На поверхность агара в чашке Петри вылить 1 мл взвеси бактерий и распределить её по поверхности, остаток культуры убрать пипеткой. После высыхания поверхности чашки на её сектора нанести пинцетом диски с антибиотиками. Выдержать чашки в течение 30 минут, после чего поместить в термостат. Б. Метод разведений. Взять два ряда пробирок: 1 – 7 пробирок по 1 мл физиологического раствора; 2 – 8 пробирок по 2 мл бульона. В первую пробирку первого ряда внести 1 мл пенициллина, содержащий 160 единиц. Содержимое пробирки перемешать и 1 мл перенести во вторую пробирку, из второй пробирки 1 мл перенести в третью и т. д. Таким образом, в пробирках будет 80, 40, 20, 10, 5 единиц и т. д. пенициллина в 1 мл. В каждую пробирку второго ряда (кроме восьмой) внести по 0,2 мл разведения пенициллина из соответствующей пробирки первого ряда. Получаем разведения пенициллина – 8, 4, 2, 1 и т. д. в 1 мл бульона. В каждую пробирку засеять одну петлю суточной бульонной культуры испытуемого микроба. Результат учитывается через сутки пребывания пробирок в термостате. Отметить наименьшую концентрацию антибиотика (наибольшее его разведение), при которой отсутствует рост микроба (бактерицидная концентрация), а также ту концентрацию при которой лишь наблюдается задержка роста культуры (бактериостатическая концентрация) по сравнению с контрольной восьмой пробиркой. 3. Постановка седиментационного метода (Коха). Чашку с питательным агаром поставить на горизонтальную поверхность, открыть её на 5 минут, после чего поместить в термостат. При учёте результатов подсчитывается число выросших колоний на чашке и рассчитывается микробное число воздуха, для чего используется таблица Омелянского.
Пример: на чашке диаметром 10 см выросло 40 колоний, количество микробов в 1 м3 воздуха составляет: 40. 60=2400. 4. Определение перфрингенс-титра эмбрионов. Перфрингенс-титр почвы – минимальное количество почвы, в котором еще определяются Clostridium perfringens. Из приготовленных 10-кратных разведений почвенной суспензии по 1 мл переносят в два параллельных ряда пробирок. Один ряд прогревают при 80°С 15 мин для уничтожения вегетативных форм. Далее пробирки заливают свежеприготовленной средой Вильсона-Блера. Посевы инкубируют при 43ºС в течение 24-48 часов, после чего учитывают результаты по образованию черных колоний. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму и обнаруживают типичные грамположительные палочки. 5. Техника заражения куриных эмбрионов. Отобрать свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводить в гнёздах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 – 37,50С, относительной влажности 63 – 65 %. Для заражения отобрать 4 – 13 – дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обработать спиртом, обжечь над пламенем и в области введения смазать 2 % йодной настойкой. Средств ввести в аллантоисную и амниотическую полости. Проколоть ножницами небольшое отверстие в скорлупе над воздушной полостью и ввести с помощью иглы шприца исследуемый материал в количестве 0,1 – 0,2 мл на глубину 1 – 2 см. Отверстие залить парафином. При заражении в полость амниона иглу шприца или пастеровскую пипетку направить к зародышу под контролем овоскопа и ввести исследуемый материал (закрытый способ заражения). При выполнении открытого способа заражения в скорлупе над воздушной полостью вырезать отверстие размерами 0,5 – 0,7 х 0,5 см, удалить скорлупную оболочку, вскрыть хорионаллантоисную оболочку, захватить пинцетом амниотические оболочки и ввести в полость исследуемый материал. Отверстие в скорлупе закрыть покровным стеклом, смоченным в расплавленном парафине. Зараженные КЭ поместить в термостат. В готовых препаратах изучить характер внутриклеточных включений, образуемых вирусами. 6. Типирование бактерий с помощью бактериофагов. Значение. На агаровую поверхность в чашке Петри вылить 1 мл бактериальной суспензии, покачиванием чашки равномерно распределить бактерии, остаток культуры удалить пипеткой. На сектора чашки нанести петлей типовые фаги. После подсыхания капель чашки поместить в термостат. 7. Определение влияния фенола на подвижность бактерий. Значение. Бактериальную культуру вырастить в МПБ и в бульоне с 1 % фенола.(термостат, 24 часа, 37 градусов). Исследовать её подвижность методом «раздавленной капли». Неподвижную культуру из пробирки с фенолом отсеять в пробирку со свежим питательным бульоном (термостат на 24 часа, 37 градусов), испытать на подвижность методом «раздавленной капли». Сделать вывод. 8. Опыт трансформации. Значение. Поместить в пробирку 1 мл раствора ДНК – культуры донора, смесь инкубировать в течение 30 минут при температуре 370С, после чего произвести высев петлёй на селективную питательную среду, содержащую 100 ед/мл стрептомицина. Одновременно произвести контрольные высевы культуры – реципиента и раствора ДНК. При учёте результатов обратить внимание на наличие роста в высеве из трансформационной смеси при отсутствии роста в контрольных высевах. 9. Опыт трансдукции. Значение В пробирку поместить 1 мл 4 – часовой культуры – реципиента – E. coli lac – , добавить 1 мл суспензии трансдуцирующего фага, содержащего форм 1 мл 10 6 – 107 частиц, смесь инкубировать в течение 60 минут при температуре 370С, после чего 0,1 мл смеси нанести на среду Эндо и распределить стеклянным шпателем по поверхности чашки. Контролем служит посев 0,1 мл культуры – реципиента на ту же среду. Чашки инкубировать в термостате. При учёте результатов следует определить число выросших колоний, способных расщеплять лактозу (окрашенных в красный цвет). Значение: Трансдукцию применяли для картирования генов бактериальных хромосом. Метод основан на том, что фрагменты бактериальной ДНК, переносимые при трансдукции, достаточно велики и могут содержать целый ряд генов, поэтому близко расположенные гены могут при трансдукции переноситься одновременно (котрансдукция). Чем меньше гены сцеплены, тем меньше наблюдается котрансдукция. На основе этой информации можно восстановить порядок следования генов на бактериальной хромосоме. 10. Способы заражения лабораторного животного Биологический (экспериментальный) метод исследования состоит в искусственном воспроизведении клинической картины инфекционных болезней на лабораторных животных. В практической микробиологии его используют для диагностики инфекционных болезней, выделения и идентификации чистой культуры возбудителя индикации и идентификации экзотоксинов. Материал для заражения должен быть забран в асептических условиях, в стерильную посуду, гомогенизирован, использован возможно быстрее. Способ заражения зависит от типа материала, вида животного, предполагаемого повреждающего агента. Материал может быть введён накожно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, через нос, рот и прямую кишку, в сердце, желудок, мозг, в вагину, яичко, конъюнктиву, в суставные полости. Перед заражением с операционного поля необходимо удалить шерсть и обработать его 70 % этанолом с последующим смазыванием настойкой йода. Подкожный способ заражения При подкожном введении исследуемого материала фиксировать животное, протереть место инъекции кусочком ваты, смоченной в спирте, захватить в складку кожу на спине у корня хвоста, ввести в неё иглу примерно до половины, медленно ввести 0,5 мл материала, отпустить складку. Затем иглу быстро извлечь, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом. Внутрибрюшинный способ заражения Животное фиксировать головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. После обработки спиртом места инъекции в левой нижней трети живота проколоть кожу, держа иглу под острым углом, затем перевести шприц в положение, перпендикулярное брюшной стенке, толчкообразным движением проколоть брюшину и ввести содержимое шприца. Извлечь иглу, прикрыв место инъекции ватой, смоченной в спирте. 11. Вскрытие и исследование трупа лабораторного животного Вскрытие и исследование трупа животного делят на 3 этапа: а) вскрытие и исследование наружных покровов Закрепить труп животного животом кверху, положив его на кусочек марли, смоченной дезинфицирующим раствором. Обработать шерсть и кожу ватным тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. Стерильными инструментами сделать разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы вдоль конечностей. Отсепарировать кожу, отметить состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов При обнаружении измененных узлов произвести из них посевы на питательные среды и сделать мазки – отпечатки на предметных стёклах. б) вскрытие и исследование грудной полости Вскрыть грудную полость, для чего сделать разрез в диафрагме, ввести в него браншу ножниц, перерезать рёбра с обеих сторон от грудины, откинуть вырезанный лоскут кверху, осмотреть органы грудной полости. При наличии экссудата сделать из него посевы и мазки. Для взятия крови из сердца прижечь пинцетом участок его, проколоть этот участок стерильной пастеровской пипеткой, набрать несколько капель крови, произвести посев и приготовить мазок. Сделать посев из ткани лёгкого и мазки – отпечатки из него. в) вскрытие и исследование брюшной полости Вскрыть брюшную полость, осмотреть её органы, обратить внимание на наличие экссудата, величину и цвет печени, селезёнки, мезентериальных лимфатических узлов. Произвести посевы из печени, селезёнки, почек, лимфоузлов и приготовить мазки – отпечатки этих органов. Для этого вырезать из ткани органа небольшие кусочки, взять пинцетом и прикоснуться к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри (рис. 2), а затем к предметному стеклу. По окончании вскрытия завернуть труп в подложенную под него марлю. 
Рис. 2. Схема посева из органов белой мыши | ||||||||||||||||||||||||||