МИКРА ЭКЗ 2019. 1. Предмет и задачи микробиологии
 Скачать 471.08 Kb.
|
|
25.Дыхание бактериальной клетки. Классификация по типу дыхания. ДЫХАНИЕ БАКТЕРИЙ Дыхание (или биологическое окисление) микроорганизмов представляет собой совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микробных клеток 3 типа дыхания в зависимости от конечного акцептора 1.Кислородное дыхание – окисление кислородом воздуха осуществляются при участии молекулярного кислорода с высвобождением большого количества энергии (АТФ, АДФ, АМФ). Перенос электронов осуществляется с помощью системы цитохромов а,в,с, цитохромоксидазы 2. Брожение Совокупность окислительно-восстановительных процессов расщепления органических веществ в анаэробных условиях Конечный акцептор – органические вещества В зависимости от преобладающих продуктов: спиртовое, маслянокислое, метановое, молочнокислое, пропионовокислое и т.д. При брожении образуются продукты, используемые для синтетических процессов в клетке 3. ГНИЕНИЕ (аммонификация) Многоэтапное анаэробное и аэробное расщепление белков и других азотсодержащих соединений Конечные и промежуточные продукты гниения являются обязательным звеном в круговороте веществ, кроме того вызывают гнилостные процессы в толстом кишечнике, гнойно-воспалительные заболевания Классификация бактерий по типу дыхания Облигатные аэробы (синегнойная палочка) Облигатные анаэробы (возбудитель ботулизма) Факультативные анаэробы (стафилококки) Аэротолерантные – (молочнокислые бактерии) Микроаэрофилы – (некоторые возбудители газовой гангрены) Капнические – (один из возбудителей бруцеллёза) 26. Особенности анаэробного дыхания бактерий. Причины токсического действия кислорода на бактерии. Методы культивирования анаэробов. Особенности анаэробного дыхания Энергетический обмен происходит при полном отсутствии кислорода Синтез АТФ происходит за счет фосфорилирования субстратов Конечными акцепторами могут быть С, N2, S Токсическое действие кислорода Эффект Пастера – угнетаются анаэробные процессы в присутствии кислорода Отсутствуют антиоксидантные ферменты (каталаза,СОД) Способы создания анаэробных условий: 1 - Механический – удаление воздуха при помощи насоса из герметически закрывающегося прибора - анаэростата 2 - Физические методы – посев в высокий столбик агара с последующей заливкой вазелином 3 - Химические методы - добавление веществ, поглощающих кислород – пирогаллол или кусочков печени, почек – среда Китта-Тароцци 4 - Биологический (метод Фортнера) – совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в запарафинированной чашке Петри. Методы культивирования анаэробов.Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве. К физическим методам создания анаэробных условий относится культивирование в микроанаэростате – вакуумном аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СО2 и 10 % Н2. К химическим методам относится: 1) Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na2S2O4), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. 2) Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, аскорбиновая кислота. Как пример биологического способа создания анаэробных условий - выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. . 27.Рост и размножение бактерий. Фазы размножения в жидкой питательной среде. Методы оценки микробного числа и микробной массы. Рост бактерий- это увеличение количества, массы и размеров всех микробной клетки, начинающийся сразу после ее деления. Рост неразрывно связан с размножением. Размножение у бактерий– процесссамовоспроизведения микробной клетки. Он начинается сразделения ДНК нуклеоида на две дочерние нити, каждая из которых затем достраивается комплементарной нитью, при этом одновременно происходит образование двух дочерних клеток (полуконсервативный способ). Рост и размножение бактерий Рост – увеличение массы (микробная масса) Размножение – увеличение количества особей на единицу объема (число/мл3) Определение числа бактерий Прямые методы – подсчет клеток камера Горяева счетчик Коултера Косвенные методы - по стандартам мутности по колониям (через 24ч) Определение микробной массы Прямой путь – м/мл3 или м/мм3 По содержанию белка, С, N2, АМК По оптической плотности Размножение бактерий Происходит путем поперечного деления: 1 стадия - перераспределение генетического материала 2 стадия – образование межклеточной перегородки путем инвагинации ЦПМ и клеточной стенки 3 стадия – расхождение клеток Фазы развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде 1 стадия – лаг-фаза 2 стадия – положительного ускорения 3 стадия – логарифмическая стадия 4 стадия – отрицательного ускорения 5 стадия – стационарная стадия 6 стадия – ускорения гибели 7 стадия – логарифмической гибели 8 стадия – уменьшения скорости гибели и остатка 28.Непрерывный и синхронный способы культивирования. Способы культивирования 1-Непрерывное культивирование в хемостате – аппарате, в котором автоматически регулируется удаление части культуры и поступление свежей питательной среды 2-Культивирование синхронных культур Синхронизация культур дает более стандартные результаты определения вирулентности, чувствительности к антимикробным препаратам. Добавляют к бактериям ингибиторы белкового синтеза для достижения одновременного деления у всех особей популяции НАВЫКИ: 1. 1-Методы исследования в Микробиологии. Все микробиологические исследования могут быть сведены к 5 основным методам: – микроскопический метод состоит в изучении исследуемого материала с помощью различных микроскопов; – бактериологический (микологический, вирусологический) метод заключается в искусственном культивировании микроорганизмов и выделении чистых культур с последующей их идентификацией (определением вида); – серологический метод основан на определении специфических антител к антигенам в крови и других биологических жидкостях пораженного организма с помощью различных реакций иммунитета; – биологический; или экспериментальный, метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с целью воспроизведения инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя; – аллергический метод заключается в постановке кожных аллергических проб с соответствующими аллергенами с целью обнаружения повышенной чувствительности макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности. 2- Увеличительная и разрешающая способности микроскопа. Особенности иммерсионной микроскопии. Современные световые микроскопы характеризуются предельной разрешающей способностью 0,2 мкм, под которой понимают наименьшее расстояние между двумя точками, различимое с помощью микроскопа. Разрешающая способность микроскопа (d) описывается формулой: d =l/NA, где l – длина волны проходящего света, NА – численная (нумерическая) апертура объектива, равная n×sins (n – показатель преломления среды между объектом и объективом, а s – половина отверстного угла, образуемого двумя крайними лучами, попадающими в объектив). Для иммерсионных объективов NA=1,25, для объективов сильного увеличения – 0,65, для объективов слабого увеличения – 0,2. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В повседневной практике обычно используют увеличение порядка 630 – 900. 3-Виды микроскопии. Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным, в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне. Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – это свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Микробы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами; люминесцирующих красителей – флюорохромами, которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, т. е. связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров. Фазово–контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их малой контрастностью. В видимом свете они прозрачны. Однако при прохождении света через микробную клетку происходит изменение фазы световых лучей, что обусловлено различиями толщины и показателей преломления отдельных структур. Эти изменения могут быть обнаружены при использовании специальных фазово– контрастных устройств, в результате чего микроорганизмы и отдельные части микробной клетки становятся контрастными и видимыми человеческим глазом. В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов, излучаемых специальным источником (электронная пушка). На пути потока электронов помещены электромагнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирующими, т. е. действует подобно линзам для световых лучей. Исследуемый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают в безвоздушной среде на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Изображение микроскопируемого объекта наблюдают на флюоресцирующем экране. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой проницаемостью для электронов. Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты величиной 10 –10000 нм. Ее широко применяют для исследования тончайших структур бактериальной клетки и функциональных особенностей ее компонентов, для изучения морфологии и биологических свойств вирусов и фагов. В сканирующем- зондовом микроскопе используют комбинации инвертированного оптического и зондового микроскопов. Минимальный шаг сканирования составляет 0,01нм. Сканирующая- зондовая микроскопия применяется для определения плотности и размеров бактерий и вирусов, определения параметров состояния мембран (эластичности, проводимости), исследования структуры ДНК, особенностей биомакромолекул и антигенов поверхности клеток. 4.Препарат "висячая" капля. Значение Приготовление препарата "висячая капля" На середину покровного стекла нанести каплю исследуемой жидкой культуры. Каплей вниз опустить покровное стекло на предметное стекло с углублением (лункой), края которого смазаны вазелином. Капля должна свободно свисать и не касаться дна краев углубления. Создается герметически закрытая камера, в которой бактерии можно наблюдать длительное время (4-6 часов). При малом увеличении найти край капли, после чего переместить ее в центр поля зрения и микроскопировать с объективом сильного увеличения и с иммерсионным объективом. Это метод микроскопирования живых бактерий при физиологических условиях роста; позволяет многодневно наблюдать объект. ВИСЯЧАЯ КАПЛЯ — метод приготовления препаратов для изучения под микроскопом микробов В живом состоянии. Введен в микробиологическую практику Р. Кохом (1876). Позволяет наблюдать размножение бактерий, характер их движения, развитие из спор вегетативных форм, явления хемотаксиса, действие иммунных сывороток и пр. Используется при изучении морфологии простейших, спирохет, дрожжей и грибов. Обычно исследуют молодую (для бактерии 24-часовую) культуру, выращенную в жидкой или плотной среде. 5. Препарат "раздавленная" капля. Значение Приготовление препарата "раздавленная капля" середину предметного стекла нанести каплю жидкой бактериальной культуры. Осторожно накрыть её покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха, после чего микроскопировать с малым сухим, а затем с большим сухим и иммерсионным объективами. РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ — метод приготовления препаратов для микроскопического исследования биологических объектов. В исследовательской практике Р. к. используют при изучении формы, размера и расположения микроорганизмов, выявления подвижности бактерий, при наблюдении за ростом и размножением микроорганизмов, для изучения реакций микроорганизмов на хим. соединения (хемотаксис) и физические факторы. 6. Прижизненная окраска бактерий. Значение Прижизненная окраска бактерий Для такой окраски применяются сильно разбавленные растворы красителей, которые не оказывают токсического действия на бактерии. На предметное стекло нанести каплю 0,001% раствора метиленового синего, в которую внести взвесь бактерий, после чего приготовить препарат "раздавленная капля" и микроскопировать его. Прижизненная окраска –метод явл. видоизменён. методом раздавленной капли, для лучшей видимости микробов прокраш. р-ром метиленовой сини или нейтр. красного (под покровное стекло). Бактерии сохраняют жизнеспособность, приобретают син. или красную окраску, отчётливо видны под микроскопом. 7.Приготовление фиксированного мазка и простой способ окрашивания. Значение. Подготовка фиксированных препаратов включает приготовление мазка, высушивание его, фиксацию и окрашивание мазка. Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1 – 1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло. Высушивание мазка проводится на воздухе или в струе тёплого воздуха. Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3 – 4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 секунд. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15 – 20 минут, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15 – 20 минут, в ацетон на 5 минут. Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. 8. Принцип и техника окраски по Граму.Значение. Техника окраски по Граму а) на фиксированный препарат поместить полоску фильтровальной бумаги и на неё нанести раство𬬠карболового генцианвиолета на 1 – 2 минуты; б) краситель слить, снять фильтровальную бумагу и обработать препарат в течение 1 – 2 минут раствором Люголя до почернения препарата; в) слить раствор Люголя и на препарат нанести несколько капель этилового спирта на 30 – 60 сек; г) промыть водой и докрасить препарат водным фуксином в течение 1 – 2 минут; д) слить краску, промыть водой, высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой. При данном методе одни бактерии окрашиваются в тёмно – фиолетовый цвет (грамположительные), другие – в красный или розовый (грамотрицательные). Сущность метода состоит в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксируют комплекс генцианвиолет – раствор Люголя, не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем. 9.Выявление капсул по методу Бурри-Гинса.Значение. Выявление капсул по методу Бурри – Гинса а) на край предметного стекла нанести каплю туши, а рядом каплю исследуемой культуры. Капли быстро перемешать и с помощью шлифованного стекла приготовить тонкий мазок; б) после высушивания мазок фиксировать над пламенем и окрасить фуксином в течение 1 – 2 минут; в) осторожно промыть водой и высушить. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается и имеет вид светлой зоны вокруг бактерий на тёмном фоне 10. Окраска включений волютина по методу Нейссера. Приготовить мазок и окрасить по методу Нейссера для выявления зёрен волютина, микроскопировать. а) фиксированный мазок окрасить в течение 2 – 3 минут уксуснокислой синькой Нейссера; б) препарат 10 – 30 секунд обрабатывать раствором Люголя; в) не промывая водой, мазок докрасить в течение 30 – 60 секунд везувином. Зёрна везувина окрашиваются в синий цвет, тела клеток – в жёлтый. 11.Окраска жгутиков по методу Леффлера. а) приготовить мазок из 18 – 24 – часовой культуры, для чего взвесь бактерий внести в каплю стерильной водопроводной воды, нанесенной на предметное стекло и высушить; б) мазок обработать в течение 15 – 20 минут протравой, содержащей 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 25 % водного раствора танина и 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа; в) мазок тщательно промыть водой, высушить на воздухе и докрасить фуксином Циля в течение 3 – 4 минут при легком подогревании; г) препарат промыть водой и высушить. 12.Выявление спор способом Ожешки а) приготовить мазок на краю предметного стекла; б) нефиксированный мазок подвергнуть протравливанию кислотой при повышенной температуре, для чего на мазок налить 1 % раствор соляной кислоты и подогреть над пламенем горелки в течение 2 – 3 минут; в) кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. При такой обработке оболочка споры размягчается и становится доступной для красителя. Далее мазок окрасить по методу Циля – Нильсена: а) на мазок поместить кусочек фильтровальной бумаги, на него налить карболовый фуксин Циля и подогреть стекло над пламенем горелки до появления паров; б) охладить, снять бумагу, промыть водой и обесцветить 5 % серной кислотой в течение 30 секунд; в) препарат тщательно промыть водой и докрасить раствором метиленового синего в течение 3 – 5 минут; г) препарат промыть водой и высушить. Карболовая кислота разрыхляет оболочку споры и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия бактериальных спор с красителями. Споры окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные тела бактерий обесцвечиваются метиленовым синим. |