Лекции. 1 Выделение нуклеиновых кислот
 Скачать 231.21 Kb.
|
|
1.4.4. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) ПЦР в реальном времени (Real-timePCR)–метод позволяет регистрировать накопление ДНК ПЦР в реальном времени с использованием флуоресценции и количественно оценить ДНК в образце. Для этой цели применяют флуоресцентные метки (флуорофоры) двух видов: 1) Интеркалирующие флуорофоры – соединения, которые встраиваются в любые двуцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты и повышают интенсивность флуоресценции. Примерами таких красителей может служить SYBR Green или SYBR Gold. Интеркалирующие красители широко используются в научных исследованиях, однако обладают существенным ограничением, поскольку регистрируют все двуцепочечные ДНК, включая неспецифичные продукты реакции. 2) Флуорофоры для меченья олигонуклеотидов – это соединения, интенсивность флуоресценции которых не зависит от связывания с ДНК и регулируется так называемыми гасителями (темновыми или флуоресцирующими). Олигонуклеотиды меченные парой флуорофор–гаситель, используют в качестве праймеров или зондов (пробы) для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. К настоящему времени разработано множество вариантов структуры меченных парой флуорофор – гаситель олигонуклеотидов. Ниже приведены наиболее часто используемые зонды. Линейные разрушаемые зонды (TaqMan) – представляют собой олигонуклеотид (25–30 н.о.), в котором 5’-концевой нуклеотид содержит флуорофор, а 3’-концевой нуклеотид – гаситель. В растворе и при отжиге на ДНК такой зонд не флуоресцирует, за сет гасителя. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, гидролизует зонд на нуклеотиды. В результате этого флуорофор и гаситель попадают в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится. Накопление флуоресценции детектируется прибором при каждом цикле ПЦР. В одной реакции можно использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. «Молекулярные маячки» (beacons) – зонд представляет собой небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать пространственную структуру – шпильку. На одном конце олигонуклеотида располагают флуорофор, а на втором – гаситель. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В такой структуре молекулы зонда, находясь в растворе, не флуоресцируют. При отжиге олигонуклеотида на молекуле ДНК мишени, происходит пространственное разнесение флуорофора от гасителя и восстановление флуоресценции. Примыкающие пробы (Lightcyaler) – в этом варианте используют два зонда, которые связывают ДНК-мишень на небольшом расстоянии друг от друга. 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго содержат флуорофор-донор и флуорофор-акцептор, соответственно. При их близком расположении флуорофор-донор поглощает свет определенной длины волны и переносит энергию на флуорофор-акцептор, по флуоресценции которого детектируют продукты амплификации. Применение примыкающих проб также позволяет использовать несколько флуорофоров, с разными спектрами испускания и детектировать в одной пробирке сигнал от разных молекул ДНК. Анализ данных ПЦР в реальном времени позволяет судить как о присутствии или отсутствии искомой НК, так и оценить ее изначальное количество, за счет регистрации накопления продуктов амплификации в течение всей реакции. Количество исследуемой НК выражают в абсолютных или относительных значениях. Определение абсолютных значений применяют для расчета количества копий НК в пробирке. Для этого необходим внешний контроль с известной концентрацией НК-мишени. Относительные количества определяют для ответа на вопрос: во сколько раз концентрация НК в одном образце больше (или меньше) чем в другом? Для коррекции массы образца, числа клеток, сохранности и количества общей НК проводят нормировку (выравнивание) результатов. Нормировку проводят по числу клеток, по суммарной ДНК, РНК, рибосомальной РНК и др. В исследованиях по определению уровня представленности транскриптов наибольшее распространение получило использование так называемых генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes). Они экспрессируются на постоянном уровне и слабо реагируют на внешние воздействия, поскольку необходимы для поддержания важнейших жизненных функций клетки. При выборе гена домашнего хозяйства, следует учитывать, что уровень их экспрессии может меняться в разных типах клеток. Расчеты результатов ПЦР в реальном времени достаточно сложны и проводятся в автоматическом режиме с использованием компьютерных программ. Одной из программ для расчета относительного количества ДНК-мишени, находящейся в свободном доступе в сети Интернет, является REST2009. Расчеты основаны на связи интенсивности флуоресцентного сигнала с концентрацией ДНК в пробирке. Сравнивают число циклов амплификации, необходимых для нарастания сигнала флуоресценции в образцах до одной и той же величины. Теоретически концентрация ампликонов при многократном повторении цикла должна возрастать экспоненциально и описывается формулой (4): Сn = С0 x 2n (4) С0 – исходное количество ДНК-мишени, Сn – концентрация ампликонов после n циклов На практике, синтез ампликонов постепенно замедляется по мере истощения компонентов реакционной смеси. Накопление ДНК в ходе ПЦР описывают кривой (рис. 4) и делят на четыре стадии: линейная фоновая фаза, стадия раннего экспоненциального роста количества ампликона, стадия линейного логарифмического роста, стадия выхода на плато. На стадии раннего экспоненциального роста эффективность амплификации максимальна в сравнении с другими стадиями. Накопление ДНК в ходе ПЦР описывается формулой (5): Сn = С0 х (1 + E)n (5) Сn – количество продуктов реакции на цикле n; C0 – изначальное количество исследуемой ДНК на первом цикле; Е – эффективность амплификации. Значение Е находится в пределах от 0 до 1, что соответствует удвоению исходного количества ДНК за цикл, а при Е = 0 образование продукта не происходит Для сравнения данных между образцами используют один из двух методов. В первом, для расчета величины n используют значение порогового цикла (Ct – от англ. threshold cycle) – точки пересечения кривой накопления флуоресценции и одинаковой для всех образцов пороговой линии. Значение Ct определяется автоматически программным обеспечением к прибору или задается вручную в пределах стадии раннего экспоненциального роста накопления флуоресценции. Во втором, используют метод прямого сравнения графиков. Для определения величины n на кривой находят точку, положение которой отражает форму кривой (Ср – от англ. crossing point). Обычно рассчитывают максимумы первой и второй производных графиков накопления флуоресценции. Значение эффективности амплификации подбирается эмпирически путем последовательных разбавлений образца.  Рис. 4. Зависимость флуоресценции от номера цикла 1 – Линейная фоновая фаза. 2 – Ранний экспоненциальный рост. 3 – Линейный логарифмический рост. 4 – Плато ПЦР в реальном времени обладает рядом преимуществ, за счет которых с его помощью, например, выявляют и идентифицируют полиморфные локусы HLA, проводят мониторинг посттрансплантационных взаимодействий, генотипируют (выявляют аллели), проводят количественный микросателлитный анализ и пренатальную диагностику генетических заболеваний и т.д. 1.5. Расшифровка первичной структуры (секвенирование) нуклеиновых кислот 1.5.1. Основные подходы и методы секвенирования Секвенирование нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) – метод, позволяющий получить описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров (нуклеотидов). Определение нуклеотидной последовательности ДНК стало возможным во второй половине 1970-х годов благодаря стремительному развитию методов молекулярной биологии (использование эндонуклеаз рестрикции, плазмидных векторов, молекулярного клонирования и электрофоретического разделения нуклеиновых кислот и т.д.). Первыми методами секвенирования были метод, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, разработанный А. Максамом и В. Гилбертом, и дидезоксинуклеотидный метод, предложенный Ф. Сэнгером. Метод Сэнгера, в модифицированном и более технологичном виде, получил наибольшее распространение. С развитием самой молекулярной биологии и смежных областей (химия, физика и информатика) были разработаны методы секвенирования нового поколения (next-generation sequencing – NGS), отличающиеся более высокой производительностью. Наиболее производительные методы, обеспечивают чтение миллиардов нуклеотидов в день. Однако, несмотря на наличие технологий с высокой пропускной способностью, дидезоксинуклеотидный метод до сих пор остается «золотым стандартом» определения нуклеотидной последовательности ДНК и широко используется в научно-исследовательских работах. Секвенирование ДНК дидезоксинуклеотидным методом по Сэнгеру. В основе метода лежит ферментативный синтез комплементарной цепи ДНК с использованием так называемых «терминаторов» или терминирующих дидезоксинуклеотидов – 2'- и 3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддНТФ: ддATФ, ддTTФ, ддЦTФ и ддГTФ), которые включаясь в растущую цепь ДНК, препятствуют (терминируют) присоединение следующего нуклеотида из-за отсутствия 3'-ОН группы. По теории вероятности, при определенном отношении концентраций дНTФ/ддНTФ и избытке молекул секвенируемой ДНК, синтез строящейся цепи может остановиться на каждом нуклеотиде исследуемого фрагмента ДНК. В итоге синтезируется набор фрагментов ДНК различной длины, 3'-конец которых заканчивается одним из терминаторов. Ф. Сэнгером было предложено проводить четыре реакции для каждого из ддНТФ и анализировать результаты реакции в полиакриламидном геле на соседних дорожках. Нуклеотидная последовательность считывалась по расположению полос на геле. В настоящее время дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК по Сэнгеру, известный так же как метод обрыва растущей цепи, претерпел многочисленные модификации, основанные на современных достижениях (рис. 5). Ферментативный синтез комплементарной цепи ДНК проводится в ходе ПЦР, в которой наряду с дНТФ используют ддНТФ. Каждый из ддНТФ помечен отдельным флуоресцентным красителем (флуорофором), что позволяет проводить реакцию в одной пробирке. Результатом такой ПЦР является синтез пула одноцепочных фрагментов ДНК разного размера и заканчивающихся одним из флуоресцентно-меченных ддНТФ. Полученные фрагменты ДНК очищают от компонентов реакционной смеси, денатурируют и разделяют по длине в линейном полиакриламидном геле методом электрофореза. Используют высоковольтный капиллярный электрофорез, позволяющий разделять фрагменты ДНК, отличающиеся всего на один нуклеотид. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводят в автоматических капиллярных секвенаторах («GE – MegaBACE», «Beckman Coulter – CEQ», «Applied Biosystems»). При прохождении меченного флуоресцентным красителем фрагмента через зону сканирования лазер, генерирующий непрерывное излучение, возбуждает флуорофор, следующая за этим эмиссия (излучение) флуоресценции улавливается детектирующим устройством. Полученные данные преобразуется с помощью программного обеспечения в текстовую информацию (нуклеотидную последовательность). Определение нуклеотидной последовательности ДНК по Сэнгеру является самым точным методом секвенирования, но обладает небольшой производительностью. Например, проект «Геном человека», занял приблизительно 13 лет и стоил порядка 3 миллиардов долларов. Однако, разработанные при реализации проекта технические решения, привели к стремительному развитию технологий секвенирования следующего поколения. Например, способ подготовки ДНК, названный методом «дробовика» («shotgun-sequencing»), послужил основой для создания массивного параллельного секвенирования, используемого в следующих поколениях секвенирования (NGS).  Рис. 5. Схема проведения секвенирования ДНК по Сэнгеру 1.5.2. Следующие поколения методов секвенирования Технологии NGS обладают высокой производительностью, скоростью, остаточно высокой точностью и позволяют решать разнообразные задачи (полногеномное секвенирование, секвенирование геномов и транскриптомов de novо, ресеквенирование с поиском заданной мутации, метагеномные исследования и т.д.). Большое значение для NGS играет биоинформатика, т.к. обработка полученных данных и сборка нуклеотидных последовательностей требует высокопроизводительного программного обеспечения. Массивное параллельное секвенирование является новым этапом в совершенствовании технологий определения нуклеотидных последовательностей. Часто их относят к методам второго поколения NGS. Принципиальное отличие технологий массивного параллельного секвенирования состоит в возможности одновременного определения первичной структуры пула нуклеиновых кислот, выделенных из различных образцов. Для дифференцировки исследуемых проб используют наборы штрих-кодов или индексов, представляющих собой олигонуклеотиды известной последовательности. Массивное параллельное секвенирование, представлено четырьмя основными технологиями: Технология 454 (Roche, Швейцария), известная так же как пиросеквенирование. Принцип технологии основан на детекции хемилюминесцентного сигнала, образующегося в результате высвобождения пирофосфата при встраивании ДНК-полимеразой соответствующего нуклеотида в процессе синтеза комплементарной цепи ДНК (http://www.454.com/). Секвенирование на молекулярных кластерах (Illumina, США). Технология основана на детекции флуоресцентного сигнала, полученного при встраивании ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК одного из четырех типов дНТФ, отмеченных соответствующим флуорофором (http://www.illumina.com/). Полупроводниковая технология секвенирования (Ion Torrent/ Life Technologies, США). Принцип технологии основан на детекции изменения рН при выделении одного протона водорода в результате встраивания дНТФ ДНК-полимеразой в реальном времени (http://www.iontorrent.com/). Циклическое лигазное секвенирование (SOLiD/ Life Technologies, США). Принцип метода основан на сшивании (лигировании) ДНК-лигазой комплементарных одноцепочечной матрице ДНК флуоресцентных зондов (восьмичленных олигонуклеотидов) друг с другом и высвобождении при этом флуоресцентной метки, которая детектируется устройством (http://www.lifetechnologies.com/). Секвенирование третьего поколения (Next-Next Generation Sequencing – NNGS) основано на определении первичной структуры единичных молекул и характеризуется отсутствием стадии амплификации фрагментов ДНК. Представлено тремя технологиями: Секвенирование одной молекулы (true Single Molecule Sequencing, tSMS; Helicos BioSciences, США). Принцип метода основан на построении комплементарной фрагменту ДНК цепи при добавлении меченых нуклеотидов, при этом в местах связывания детектируется свечение, после чего метки от присоединенных нуклеотидов удаляют и вводят следующий тип меченых нуклеотидов. В настоящее время компания Helicos BioSciences прекратила свое существование, и данная технология не поддерживается. Секвенирование единичных молекул в реальном времени (Single Molecule RealTime, SMRT; Pacific BioSciences, США). Принцип метода основан на достройке в режиме реального времени комплементарной однонитевой матрице цепи ДНК-полимеразой, закрепленной на дне специальных ячеек, при этом сигнал от каждого присоединившегося нуклеотида, помеченного определенной светящейся меткой, фиксируется прибором (http://www.pacificbiosciences.com/). Секвенирование через нанопоры (Oxford Nanopore Technologies, Англия). Принцип метода основан на протягивании через нанопору отрицательно заряженного одноцепочечного фрагмента ДНК, при этом регистрируется изменение электропроводности нанопоры с помощью электродов по мере прохождения через нее нуклеотидов, каждому из которых (в силу физического различия нуклеотидных оснований) соответствует определенное изменение электропроводности (https://nanoporetech.com/). Существуют также другие варианты реализации секвенирования ДНК через нанопоры, но в настоящее время научно-исследовательские разработки нанопорных секвенаторов находятся на опытно-конструкторской стадии. Таким образом, современные методы секвенирования продолжают активно развиваться и совершенствоваться для выполнения разноплановых задач, связанных с определением нуклеотидной последовательности ДНК, а так же с целью увеличения производительности, скорости и точности секвенирования. 1.6. Методы иммунного анализа При проведении лабораторных исследований часто возникает необходимость определить наличие или количественное содержание ряда биологических компонентов (гормонов, ферментов, нейропептидов, продуктов иммунной системы, антигенов и т.д.). Данная задача может быть решена с использованием методов иммунного анализа, основанного на специфическом связывании антитела с антигеном, при котором к одному из компонентов химически присоединена метка. Данные методы дают возможность идентифицировать исследуемые соединения в низких и очень низких концентрациях (до 5 пкг/мл). В зависимости от типа используемой метки и способа детекции сигнала иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и др. Наиболее распространенным в настоящее время является ИФА, использующий в качестве метки фермент. При детекции в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически. Использование ИФА в лабораторной практике значительно расширилось с появлением возможности иммобилизации антигена и антитела на твердых носителях с сохранением их связывающей активности. По типу химического взаимодействия на первой фазе анализа при связывании определяемого компонента методы иммунного анализа можно разделить на конкурентные и неконкурентные. В случае использования неконкурентного метода в системе присутствуют только анализируемый компонент и специфические антитела с соответствующими центрами связывания. При конкурентном варианте ИФА меченый ферментом анализируемый компонент иммобилизуется на твердой фазе, а в системе присутствует еще и его аналог, конкурирующий за центры специфического связывания. По стадиям проведения различают прямой и непрямой варианты анализа. В случае прямого ИФА используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой, являющейся субстратом ферментативной реакции. В непрямом анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а на втором этапе добавляют антивидовые меченые антитела. Чаще всего для первого этапа используются мышиные, а для второго – козьи антитела. Наиболее удобным в постановке является «сэндвич»-метод. На первом этапе анализа на полистироловом планшете адсорбируются антигены или антитела в заранее подобранной концентрации. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты удаляются отмыванием. В сенсибилизированные лунки вносятся исследуемые образцы. В лунки с положительным и отрицательным контролем вносятся стандартные реагенты, содержащие или не содержащие исследуемый компонент. При необходимости анализа количественного содержания белка вносятся калибровочные растворы. После этого планшет инкубируют с использованием термошейкера или термостата. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием. На следующей стадии в лунки планшета вносится конъюгат антитело-фермент или антиген-фермент, который и связывается с иммобилизованным иммунным комплексом, при этом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Последующая инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии и по оптической плотности оценить выраженность окрашивания. Развитию ИФА способствовало создание моноклональных антител, продуцируемых гибридомой, полученной в результате слияния иммунокомпетентной клетки В-лимфоцита и клетки миеломы мышей. Моноклональные антитела несут только одну химически однородную популяцию антител, комплементарную специфической детерминанте антигена, что позволяет осуществлять тонкую дифференциацию белков. В настоящее время развитие иммуноферментного анализа идет как по линии повышения чистоты антигенов и антител, так и по линии создания автоматизированных систем постановки реакций и их инструментального учета. В настоящее время приобретает популярность ИФА с использованием магнитных частиц (MPEIA). В данном случае образование иммунных комплексов осуществляется на полистироловых магнитных шариках диаметром около 0,8 мкм, которые помещают в лунки планшета. Особенностью данного метода является то, что стадии промывки и детекции результатов проводят с дополнительным использованием магнитного сепаратора, с помощью которого шарики фиксируюся на дне лунки. Для данного метода также существует модификация с использованием флуоресцентных меток, позволяющая увеличить число определяемых в одном измерении компонентов за счет использования шариков разного цвета, детектируемых с помощью специального анализатора (технология Bio-Plex). |