2Билет Плазмиды — внехромосомные мобильные генетические структур. 2Билет Плазмиды
 Скачать 421.5 Kb.
|
|
Билет3 Выделение ДНК. Методы выделения. Биотехнология получения трансгенных растений Процедура получения ГМО включает в себя несколько основных этапов: • Выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам. Для этого из организмов, обладающих такими генами, с помощью специальных химических методов выделяют нуклеиновые кислоты. Их разрезают на отдельные фрагменты, используя наборы ферментов-рестриктаз. Наибольшее значение имеют рестриктазы, способные разрезать нуклеиновые кислоты с образованием, так называемых липких (комплементарных) концов. Образующиеся фрагменты имеют короткие однонитчатые концы, состоящие из нескольких нуклеотидов. Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения (н-р, фрагменты плазмид бактерий и фрагменты животной или растительной ДНК), полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей липкие концы, и добавить фермент – лигазу, то эти фрагменты соединятся между собой. В результате получится химерная (рекомбинантная) ДНК, которая может содержать фрагменты ДНК, выделенные из различных организмов или синтезированную искусственно. Описанная технология позволяет создавать на основе плазмид (или других типов векторов) сложные генетические конструкции, предназначенные для переноса в клетки других организмов. • Клонирование (размножение) переносимого гена. Чтобы размножить созданные в пробирке немногочисленные химерные молекулы ДНК, векторы со встроенными в них фрагментами необходимо перенести в реципиентные клетки. Плазмидные векторы обычно вводятся в реципиентные клетки методом генетической трансформации. Особенно широкое распространение для клонирования векторных ДНК получила трансформация клеток кишечной палочки (E. сoli), основанная на совместной инкубации «компетентных» клеток бактерий (клетки способные к трансформации) и ДНК. В результате трансформации ДНК «поглощается» бактериальными клетками и автономно размножается в их цитоплазме (внутренняя среда клетки). На селективной среде ведут отбор трансформированных бактериальных клеток, несущих какой-либо селективный маркер, который уже был на векторе или должен был появиться в процессе образования рекомбинантной молекулы. Если, например, вектор содержал ген устойчивости к антибиотику ампицилину, то в селективную среду, добавляют этот антибиотик, и все выжившие клетки будут содержать данный вектор. Для того, чтобы выяснить, несут ли трансформированные клетки рекомбинантную ДНК, из клеток выделяют векторную плазмиду и подвергают её электрофорезу. Метод электрофореза основан, на принципе перемещения веществ в электрическом поле от одного полюса к другому со скоростью, зависящей от их размеров. С помощью этой простой техники можно в агарозном геле разделить, идентифицировать и очистить фрагменты векторной ДНК различной молекулярной массы. • Перенос гена (или трансгенной конструкции) внутрь клетки и встраивание его в ДНК реципиентного организма. Основной способ переноса генов (генных конструкций) из клеток организма–донора в клетки организма–реципиента - это процесс трансформации. Трансформация включает в себя несколько основных этапов и требует соблюдения ряда условий: наличия трансформирующей ДНК; «компетентных» клеток; интеграции донорской (трансформирующей) ДНК в ДНК реципиента и экспрессии (работы) перенесённых генов. Существуют различные методы трансформации: путем гибридизации соматических клеток; инкубации реципиентных клеток с чужеродным генетическим материалом; микроинъекцией генетического материала в ядра клеток животных и др. Их применение, прежде всего, зависит от биологических особенностей организма – реципиента. Например, для трансформации клеток растений используют два основных метода. 1) Метод биологической баллистики. В этом случае, на мельчайшие частицы вольфрама или золота напыляется ДНК, содержащая «целевой» ген. Затем эти частички с ДНК помещают в так называемую генную «пушку». В результате «выстрела» они с огромной скоростью «бомбардируют» клетки растений, проникая в их цитоплазму и ядра. Некоторые из этих клеток встраивают «целевой» ген в свою ДНК. Из каждой такой клетки может быть регенерировано новое трансгенное растение. 2) Трансформация растения с помощью, так называемой, Ti – плазмиды, несущей «целевой» ген, который доставляется в клетки с помощью почвенной бактерии (Agrobacterium tumifaciens). Ti–плазмида - это кольцевая молекула ДНК содержащаяся в клетках Agrobacterium tumifaciens, вызывающей образование опухолей у растений при их заражении этой бактерией. При заражении бактериями растений, небольшой фрагмент Ti–плазмиды встраивается в геном растительных клеток, вызывает нарушение гормонального баланса и переход к неконтролируемому делению и росту, что и приводит к образованию опухоли. «Целевой» ген, способный изменять то или иное свойство растения, встраивается генно-инженерными методами в Ti–плазмиду, которая, затем переносится в агробактерию. В процессе совместного культивирования агробактерии и культуры клеток растения – хозяина Ti–плазмида попадает в клетки растений, а «целевой» ген с дополнительными фрагментами ДНК встраивается в растительный геном. Каждая такая клетка может быть, затем регенерирована в целое трансгенное растение, которое будет содержать генетическую информацию из двух или нескольких различных организмов. Это метод применяется для трансформации двудольных растений. Однако этот метод "работает" не на всех растениях: агробактерия, например, не заражает такие важные пищевые растения, как рис, пшеница, кукуруза. Поэтому разработаны и другие способы. Например, можно ферментами растворить толстую клеточную оболочку растительной клетки, мешающую прямому проникновению чужой ДНК, и поместить такие очищенные клетки в раствор, содержащий ДНК и какое-либо химическое вещество, способствующее ее проникновению в клетку (чаще всего применяется полиэтиленгликоль). Иногда в мембране клеток проделывают микроотверстия короткими импульсами высокого напряжения, а через отверстия в клетку могут пройти отрезки ДНК. Иногда применяют даже впрыскивание ДНК в клетку микрошприцем под контролем микроскопах. • Выявление трансгенных клеток (организмов). Процесс переноса и включения в генетический материал клеток растений чужеродной ДНК происходит с достаточно небольшой частотой, в лучшем случае трансформированной оказывается 1 клетка на 1000. Поэтому необходимо каким-то образом отделить такие клетки от остальных создать для их деления и развития наиболее благоприятные условия. В этом случае вместе с «целевым» геном (например, устойчивости к гербицидам, вирусам и насекомым – вредителям) вводят и второй, так называемый селективный ген. Чаще всего для этого используют гены устойчивости к антибиотикам. Если после введения чужеродной ДНК поместить клетки на питательную среду с антибиотиком, то на ней способны будут расти только трансформированные клетки. Билет4 Применение генно-мод-х животных и микроорганизмов генная инженерия животных Есть два способа генетической модификации животных: путем изменения соматических клеток (клеток тела) и половых клеток. Первый путь приводит к изменению клеток индивидуального организма, получившего модификацию, а вот второй приносит новые наследуемые признаки. Модификация соматических клеток состоит из четырех этапов. 1. Удалить клетки из организма. 2. Сделать из них культуру клеток. 3. Трансформировать клетки вектором, содержащим ген, который желательно ввести в клетки. 4. Вновь ввести трансформированные клетки в организм. Это основная схема, применяемая в генной терапии Изменение половых клеток дает организмы с новыми наследуемыми признаками. Организм, передающий новые признаки своему потомству, называется трансгенным, а новый ген, введенный в организм, — трансгеном. Процесс получения трансгенных животных оказался гораздо сложнее введения новых генов бактериям. Однако к настоящему времени создано много трансгенных животных. Вот только несколько примеров: • мыши модифицированы для различных целей. Некоторым введены человеческие гены для получения нечеловеческой модели человеческих болезней. Например, измененные методами генетической инженерии мыши несут человеческий ген клеточного рецептора для вируса полиомиелита. В отличие от нормальных мышей они могут быть заражены данным вирусом, у них даже развиваются симптомы этой болезни. Другим примером могут стать мыши с иммунной системой человека, которые позволяют исследовать ее без участия больных людей; • куры успешно изменены генными инженерами и несут яйца, в белке которых содержатся потенциально полезные человеческие белки; • генетически модифицированные овцы продуцируют человеческий ген альфа 1-антитрипсина в молоке. Люди, наследующие два нефункционирующих гена этого белка, страдают болезнью, называемой альфа 1-антитрипсиновой недостаточностью. Она поражает легкие и иногда печень; • исследователи из Гелфа, Онтарио создали «Енвиросвинью», генетически модифицированную так, что в ее навозе содержится на 60% меньше фосфора; • козы, измененные методами генетической инженерии, дают молоко, содержащее человеческий инсулин или белки паутины пауков (не одновременно, конечно). Методы модификации, использованные при работе с различными животными, отличаются, но два метода, примененных на мышах, дают представление о типичной модификации В методе эмбриональных стволовых клетокиспользуются стволовые клетки эмбриона, обладающие потенциалом превращаться в клетки любой ткани организма. Они собираются с внутренней стороны бластоцита мышей (мыши на очень ранней стадии развития после зачатия). Ген, выражение которого исследователи хотят получить у мыши, выделяется и клонируется методами, описанными выше. В составе соответствующего вектора новый ген, несущий необходимые последовательности промотора и энхансера, вводится в стволовые клетки. Среди полученных в результате клеток ведется поиск несущих нужный ген, успешно встроенный не просто в клетку, а в нужное место генома. Эти трансформированные клетки культивируются, потом вводятся во внутренний массив клеток мышиного бластоцита, который переноситсяпсевдобеременной самке, то есть скрещенной со стерильным самцом для инициации гормональных изменений, приводящих к изменениям в матке. Эти изменения позволяют ей принять эмбрион. Не более трети эмбрионов разовьется в здоровых мышат. Из них только у 10 — 20% будет обнаружен желаемый ген, и мышата будут гетерозиготными, то есть несущими одну копию данного гена. Полученных мышей скрещивают друг с другом, а среди их потомства ищут одну из четырех мышей (по закону Менделя), которая будет гомозиготной, т.е. несущей две копии гена. Скрещивание гомозиготных мышей стабилизирует новую линию трансгенных особей, у которых выражается новый ген, введенный исследователями. Второй метод называетсяметодом проядра. Он заключается в получении свежеоплодотворенных яйцеклеток, а донорская ДНК (получение которой описано в предыдущем методе) вводится в головки сперматозоидов до образования проядра. Как только оплодотворенное яйцо образует ядро и делится, превращаясь в двуклеточный эмбрион, он вводится псевдобеременной мыши. После этого процесс полностью повторяется, как в первом методе. Билет5 Биотехнология получения генетически измененных растений. (3билет 2 вопрос) 2) Методы селекции микроорганизмов с заданными свойствами (конкретные примеры) Билет6 Генетическая инженерия: сущность и задачи Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии. На рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам. Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа: Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование. Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности. Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных. Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг и С. Коэн с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli. Понятие о генной инженерии Одним из разделов молекулярной генетики и молекулярной биологии, который нашел наибольшее практическое приложение, является генная инженерия. Генная инженерия – это сумма методов, позволяющих переносить гены из одного организма в другой, или – это технология направленного конструирования новых биологических объектов. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100г кристаллического инсулина требуется 800-1000кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. Цели и задачи генной инженерии Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания. Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, передающие мутантный ген потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
|