Миниатюризация этапа разделения позволяет значительно сократить количество образца, необходимого для анализа. Даже для обычных источников ионизации электроспреем типичная скорость потока обычно находится в порядке нескольких микролитров в минуту. Такие требования к скорости потока оптимально сопоставляются микро-ВЭЖХ системами, в то время как использование обычной ВЭЖХ колонки требует либо постколоночного разделения потока элюента перед его введением в источник ионизации электроспреем, либо использование источников «ионоспрэя» способных обрабатывать высокий скорости потока. Несмотря на совпадение скоростей потока ВЭЖХ и ESIMS, необходимо быть в курсе другой важной технической задаче, относящейся к совместимости растворителей. Обращенно-фазовая жидкостная хроматография пептидов и белков обычно выполняется с помощью трифторуксусной кислот, в качестве модификатора элюента. ТФУ является очень сильным электролитом (pKa<0.5), и её присутствие в растворителе обычно ухудшает качество ESIMSданных. Если необходимо, вредящий эффект ТФУ в ESIMSизмерениях может быть нивелирован, используя два разных подхода. В первом подходе, концентрация ТФУ в элюенте уменьшается, за счет смешивания его с потоком жидкости, содержащей летучие ион-спаривающие агенты, этот шаг может быть выполнен либо «постколоночно» либо в источнике ионизации электроспреем. Более утонченные схемы используют второй хроматографический этап, чья подвижная фаза модифицируется с летучими реагентами. Альтернативный подход использует слабые кислоты (такие как укусусная или муравьиная кислота вместо ТФУ) во время разделительного шага. Неизбежная потеря хроматографической точности, если компенсируется масс-спектрометрической детекцией, позволяет плохо разделенным аналитам быть легко различимыми, основываясь на различиях в их массах. Традиционно, жидкостная хроматография не была рассмотрена как «быстрый» метод химического анализа и плохо подходила для высокопропускных анализов. Кропотливая природа хроматографии стимулировала разработку методов, которые улучшили скорость разделения. Как мы увидим в Главе 4 и 5, быстрое ВЭЖХ разделение пептидных фрагментов является ключевым фактором для высококачественного анализа белковых динамик за счет мониторинга реакций гидроген-дейтериевого обмена (HDX) в сайт-специфичной манере. Значительные улучшения в скорости разделения могут быть достигнуты используя меньшие и без пор или со специфическими порами частицы, в качестве материала наполнения колонки. Потенциал быстрых разделений может быть позднее увеличен, используя капиллярные колонки, монолитные колонки, открытые цилиндрические колонки, а также капилляры с малым диаметром. Повышенные температуры могут быть также эффективными для улучшения времени анализа. Однако, HDXHPLSMSизмерения (наиболее требовательные быстрые методы в биофизических исследованиях до сих пор) обычно выполняются при низких температурах для избежания чрезмерного обмена дейтериумовых атомов между пептидами и подвижной фазой во время этапа разделения. Увеличение скорости разделения обычно достигается затратой качества разделения. Опять же, это обычно компенсируется за счет высокой детекционной специфичности масс-спектрометрии. Много полезной практической информации о различных техниках ВЭЖХ МС можно также найти в коллекции собранной и отредактированной Ниссоном. Капилярный электрофорез (СЕ) это другая разделительная техника, которая может быть сопряжена непосредственно с ESIMS. Однако, разработка СЕ-ESIMSинтерфейсов технически более сложна за счет проблем, связанных с высоким напряжение применяемым капиллярным электрофорезом для аналитического разделения. Несколько экспериментальных схем, которые могут быть использованы для обхода этой проблемы, детальное рассмотрение которого может быть найдено в недавней обзорной статье Томера. Хотя число применений «онлайн» CE-ESIMSсистем все ещё отстает от применения HPLC-ESIMS, прошлой методики, быстро набирающей популярность за счет своей превосходящей чувствительности и разрешения. Некоторые великолепные обзоры предоставляют подробные сведения о последних событиях в этой области. |
Скачать 102.87 Kb.