Взаимодействие ESIMSс другими типами разделений, такими как иммобилизованная металл-ионная афинная хроматография (IMAC) или биоафинная хроматография, также возможно, хотя связь не может быть непосредственной и вовлекает промежуточный HPLCэтап. Краткий обзор этих многомерных хроматографических техник может быть найден в обзоре Томера. Наше внимание фокусируется в этом разделе на ESIMSкак на «детекторном устройстве». Применение жидких матриц в МАЛДИ при атмосферном давлении (кратко обсуждено в предыдущем разделе данной главы) открывает возможность для «онлайн» LC-MALDIMS. Непосредственная связь LCи МАЛДИ МС может быть также быть связяна с использование устройств с непрерывным потоком или аэрозоля МАЛДИ МС. К сожалению, даже краткое обсуждение этих устройств выходит за рамки данной книги; однако, интересующийся читатель может быть отослан к недавним обзорам по этому предмету (93-95). 3.4. Тандемная масс-спектромтерия. Одной из наиболее привлекательных функций как ESIтак и МАЛДИ для биомолекулярного анализа является их способность производить цельные макромолекулярные ионы в газовой фазе. Пока информация о молекулярном весе является очень полезной, это не существенно в большинстве примеров для недвусмысленной идентификации даже маленьких пептидов. Более того, в то время, как измерения массы высокого разрешения могут иногда выявлять молекулярную формулу маленьких пептидов, они не обеспечивают какую-либо информацию об их ковалентной структуре. Последняя может быть получена с помощью индуцированной диссоциации молекулярного иона и измерения масс получившихся фрагментных ионов. Поскольку большинство белков и пептидов являются линейными полимерами, разрыв одинарной ковалентной связи вдоль скелета молекулы производит фрагментный ион (или два комплементарных фрагментных иона) который классифицируется как a-, b-, c- или x-, y-, z-тип, в зависимости от типа разорванной связи и содержит ли фрагментный ион N- или С-концевую часть пептида. Циклические и дисульфидно-связанные полипептиды это особенный случай, поскольку единичный разрыв связи не обязательно образует различные (физически разделенные) фрагменты. Номенклатура для фрагментации циклического пептида может быть найдена в источнике (98). 3.4.1. Базовые принципы тандемной масс-спектрометрии. Ионная диссоциация часто может быть проведена в источнике ионизации, например, за счет увеличения потенциала десольватации в ESIинтерфейсе [«диссоциация с насадкой-флотатором» впервые получена Александровым и его коллегами] или используя высокую лазерную мощность в МАЛДИ. Если образец является гомогенным, такая фрагментация в источнике может быть использована для биополимерного секвенирования. В большинстве случаев, однако, образецподлежащий анализу, является скорее гетерогенной сместь, и спектр фрагментации выполненной в источнике ионизации будет очень сложно интерпретируемым за счет присутствия фрагментных ионов, полученных из различных «прекурсорных» ионов. Одним путем для решения этой проблемы является использование онлайн разделения аналитов перед их введением в источник ионизации (например, HPLC-ESIMSоборудование, обсужденное в предыдущем разделе). Однако, наиболее гибким и мощным решением данной проблемыявляется использование самого масс-спектрометра, как устройства разделяющего ионы, которое позволяет фрагментирование отобранных по массе прекурсорных ионов, выполненное разнообразными путями. Этот подход для структурной характеризации молекулярных ионов был впервые открыт Мак Лафферти и известен как тандемная масс-спектрометрия или MS/MS. Тандемный спектр пептидных ионов является легко интерпретируемым (обеспечиваемый фрагментационный выход достаточно высок), так как он содержит вклад каждого одиночного иона предшественника. Хотя процесс отбора масс сильно уменьшается перекрывающим сигналом ионной интенсивности, сигнал-к-шуму отношение достигается в MS/MSэкспериментах часто лучше, чем в MS1 эксперименте за счет устранения химического шума. |
Скачать 102.87 Kb.