Тема № 7. Ферменты. 7 ферменты цель изложения материала ознакомить студентов со строением, свойствами, механизмом действия и биологической ролью ферментов.
 Скачать 396.29 Kb.
|
|
Лекция №7 ТЕМА № 7 ФЕРМЕНТЫ Цель изложения материала ознакомить студентов со строением, свойствами, механизмом действия и биологической ролью ферментов. Задачи рассмотреть вопросы согласно следующего плана Понятие о ферментах. Применение ферментов. Номенклатура и классификация ферментов. Химическая природа ферментов. Простые и сложные ферменты. Кофакторы и их роль в процессе катализа Мономерные и олигомерные ферменты. Изоферменты и их роль в диагностике различных заболеваний. Общие закономерности строения активных центров ферментов. 3.4. Аллостерический центр фермента и его роль в процессе катализа. 4. Основные свойства ферментов. Единицы активности ферментов. 5. Механизм действия ферментов. 6. Регуляция ферментативной активности. Понятие о ферментах. Применение ферментов Ферменты - это специфические белки, образующиеся в клетках живых организмов и катализирующие происходящие в них химические реакции. Еще с глубокой древности человек использовал ферментативные процессы в хлебопечении, виноделии, обработке кожи т.д., ноне понимал их сущности. Первые попытки сделать это относятся к XVII веку, когда, пытаясь объяснить механизм пищеварения, его сравнивали с процессом брожения так появился термин фермент, введенный Я. ван Гельмонтом (от лат. fermentatio брожение. В 1814 году русский химик К.Кирхгоф показал, что крахмал превращается в мальтозу под действием проросших зерен ячменя (солода, а в 1833 году А.Пайен и Ж.Пирсо это вещество выделили и назвали его диастазой (в последствие оно получило название амилаза. Т.Шванн в 1836 году открыл в желудочном соке фермент пепсин. В 1837 году Й.Берцелиус показал, что ферменты это катализаторы, поставляемые живыми клетками. В 1862 году А.Я. Данилевский выделил из сока поджелудочной железы амилазу, липазу и трипсин. По мере открытия и изучения ферментов назрела необходимость объяснить природу их действия. Л.Пастер считал, что ферментативные процессы неотделимы от жизнедеятельности дрожжевой клетки, с другой стороны Ю.Либих отстаивал химическую 2 природу брожения, считая, что ферменты могут проявлять свое каталитическое действие как вместе с клетками, таки вне их. Авторитет Пастера, однако, был велик, к томуже все эксперементальные данные того времени говорили , что брожения не может быть без живых дрожжевых клеток и Пастер победил. После этого появились понятия организованные и неорганизованные ферменты. Организованными называли те ферменты, каталитическая активность которых проявляется лишь при наличии живых организмов (например , ферменты, вызывающие различные виды брожения, а неорганизованными – те, которые структурно не связаны с клетками ( например, ферменты, содержащиеся в желудочном и кишечном соках. В 1878 году Ф. Кюне предложил неорганизованные ферменты называть энзимами, аза организованными сохранить название ферменты. Спор между Пастером и Либихом был разрешен в результате работ М. Манассеиной и Э. Бухнера. Русский врач М.М.Манассеина в 1871 году показала, что дрожжевой сок обладал такой же способностью сбраживать углеводы, как и сами дрожжевые клетки. Эти опыты впоследствии были подтверждены Э.Бухнером. Термины фермент и энзим стали употребляться как синонимы. В 1894 году Э.Фишер предложил гипотезу, объясняющую специфичность действия ферментов ключ замок Вначале века И.П.Павлов, работая с пищеварительными ферментами, впервые доказал, что они в живом организме могут существовать в неактивной форме в виде проферментов, им также были предложены первые методы определения активности ферментов. В 1913 году Л.Михаэлис и М.Ментен разработали теорию механизма действия ферментов и кинетику ферментативных реакций. Важным шагом в изучении активности ферментов явилось их получение в кристаллическом виде уреаза (Д.Самнер, 1926 г пепсин (1930), трипсин (1931, Д.Нортроп), что подтвердило белковую природу ферментов. В 1960 году Д.Филлипс впервые расшифровал трехмерную структуру лизоцима с помощью рентгеноструктурного анализа. В 1969 году была синтезирована рибонуклеаза (Р.Мерифилд). Основными направлениями современной энзимологии являются исследования механизмов синтеза ферментов и регуляция их активности изучение более тонких деталей молекулярного механизма действия ферментов создание синтетических аналогов ферментов, наделенных аналогично нативным ферментам высокой активностью и специфичностью действия. Ферменты широко применяются в различных отраслях народного хозяйства, в том числе в медицине, ветеринарии ив животноводстве. В связи с высокой специфичностью действия ферменты используются в диагностических целях Разделом клинической биохимии является энзимология, которая изучает изменение ферментного спектра организма и активности ферментов при патологических процессах. Так, например, при паренхиматозной желтухе в сыворотке крови резко возрастает активность аланинами- 3 нотрансферазы, а при механической желтухе и патологии костной ткани щелочной фосфатазы, при заболеваниях поджелудочной железы – амилазы, при патологии печении миокарда – лактатдегидрогеназы и аминотрансфераз. Широко распространено в медицине применение ферментативных препаратов при лечении различных заболеваний (энзимотерапия). Например, гиалу- ронидаза применяется при артритах, глазных заболеваниях, она также ускоряет всасывание различных солевых растворов, вводимых подкожно, т.к. происходит деполимеризация мукополисахаридов и увеличивается проницаемость тканей и сосудистых стенок . Препараты трипсина в сочетании с антибиотиками используют для лечения хронических воспалений конечностей. Панкреатическая ДНК-аза применяется для лечения некоторых респираторных заболеваний. При лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта применяются ферментативные препараты пепсина, трипсина, химотрипсина и их смеси. РНК-аза, гиалуронидаза, эластаза, коллагеназа применяются для обработки ран, воспалительных очагов, ожогов, устранения отеков, гематом. Аспарагиназа, расщепляющая аспарагин, необходимый для синтеза белков раковыми клетками, используется при лечении злокачественных образований. Использование очищенных индивидуальных ферментов длительное время сдерживалось их дороговизной и невысокой устойчивостью. Применение ферментов, достаточно прочно связанных иммобилизованных с нерастворимыми полимерными материалами, прежде всего, сделало процессы более технологичными. Появилась возможность использовать непрерывные процессы, основанные на пропускании раствора субстрата через колонку с иммобилизованным ферментом. Исчезла проблема отделения прореагировавших компонентов от фермента, резко повысилась эффективность использования фермента. Оказалось также, что связывание с носителем часто повышает термическую устойчивость фермента. Применение иммобилизованных ферментов вместо растворимых оказалось в ряде случаев предпочтительными при использовании ферментов в качестве медицинских препаратов, которые в силу большей устойчивости дольше удерживаются в организме. Иммобилизованные ферменты в качестве лекарственных средств начали применять в специальных аппаратах типа искусственной почки. Такое лечение полностью исключает нежелательные воздействия чужеродного белка и может проводиться в течение длительного времени. Кроме того, можно создавать разнообразные удобные для применения формы имммобилизованных ферментов. Например, иммобилизация протеаз на целлюлозе позволяет получать обладающие протеолитической активностью повязки и тампоны, что удобно при использовании таких ферментов для заживления ран, язви прочих повреждений тканей. В клинике практике кроме ферментов используют и их ингибиторы. Например, для снижения свертываемости крови применяют ингибитор фибри- нолизина аминокапроновую кислоту При лечении острых панкреатитов применяют препарат тразилол, который ингибирует протеолитические ферменты В животноводстве ферментные препараты используются для повышения эффективности использования питательных веществ корма Эти ферментные препараты дополняют выделяемые организмом ферменты и значительно ускоряют расщепление питательных веществ корма, повышая полноту усвоения компонентов корма. Номенклатура и классификация ферментов Для названия ферментов используются тривиальная, рациональная и систематическая номенклатура. Тривиальная номенклатура употребляется для ограниченного числа ферментов (пепсин, трипсин, химотрипсин и некоторых других. Ее достоинство краткость. Более распространенной и употребляемой в практике является рациональная номенклатура. Название ферментов по ней складывается из корня латинского названия субстрата с прибавлением суффикса -аза (амилаза, мальтаза и др. В ряде случаев в названии фермента может быть отражен тип катализируемой реакции (лактатдегидрогеназа, пируватдекарбоксилаза и др. Достоинством этой номенклатуры является краткость, а недостатком ограниченная, а в ряде случаев и отсутствие информации о химической природе субстрата и типе реакции. В 1961 году была принята международная (систематическая номенклатура, названия ферментов по которой складываются из названий субстратов, типа катализируемой реакции с прибавлением суффикса - аза. Каждому ферменту присваивается шифр, основанный на четырехзначном десятичном коде. я цифра указывает номер класса, к которому относится фермент, я номер подкласса, я номер подподкласса и я порядковый номер фермента в подподклассе. Вначале шифра ставятся буквы КФ (классификация ферментов. Пример C OOH СООН НАД HO C H СО НАДН+Н + CH 3 СН 3 L- лактат пируват Название фермента катализирующего вышеуказанную реакцию по рациональной номенклатуре лактатдегидрогеназа (отщепление двух атомов водорода от молочной кислоты, а по международной лактат НАД- оксидоредуктаза (в качестве субстратов выступают молочная кислота и кофермент НАД, а тип реакции окислительно-восстановительная, те. оксидоредук- ция). Шифр фермента КФ 1.1.1.27. 5 Достоинство систематической номенклатуры полная информация охи- мической природе субстратов и типе катализируемой ферментом реакции, а недостаток громоздкость, поэтому она применяется в основном в научных исследованиях при первом упоминании того или иного исследуемого фермента. По мере открытия новых ферментов, изучения их свойств возникала необходимость в классификации ферментов В зависимости от типа катализируемой реакции все ферменты делятся на 6 классов 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы). Классы ферментов делятся на подклассы, а те в свою очередь на под- подклассы. Подкласс уточняет действие фермента, так как указывает в общих чертах на природу химической группы субстрата, атакуемой ферментом. Под- подкласс еще более конкретизирует действие фермента, уточняя природу атакуемой связи субстрата или природу акцептора, который участвует в реакции. Ферменты класса оксидоредуктаз катализируют окислительно-восста- новительные реакции. К этому классу относятся ферменты дегидрогеназы, участвующие в переносе атомов водорода. Они подразделяются на анаэробные H H схема реакции S 1 S 2 S 1 S 2 \ \ H H перенос атомов Н на любой S кроме О 2 и аэробные H S O 2 S H 2 O 2 акцептором Н служит О \ H К классу оксидоредуктаз также относятся цитохромы. Эти ферменты участвуют в переносе электронов. Например, цитохромы a, b, c. Цитохромоксидаза (цитохром a 3 ) переносит электроны на О 6 Ферменты каталаза и пероксидаза, относящиеся к классу оксидоредук- таз, участвуют в переносе атомов водорода на акцептор, которым является пероксид водорода: Н 2 О 2 + НО 2 НО + О каталаза Н S + НО S + 2 НО \ пероксидаза Н Трансферазы катализируют реакции межмолекулярного переноса различных групп и остатков В зависимости от типа переносимой группировки различают метилтрансферазы перенос групп СН 3 ); ацилтрансферазы (перенос ацильных групп RC=O); \ гликозилтрансферазы (перенос остатков углеводов, например, фермент гликогенфосфорилаза переносит остаток глюкозы с гликогена на фосфорную кислоту с образованием глюкозо-1-фосфата в процессе расщепления гликогена аминотрансферазы (перенос аминогрупп NH 2 с аминокислоты на кетокислоту в процессе синтеза заменимых аминокислот СООН СООН СООН СООН СНNH 2 + C=O C=O + CHNH 2 CH 3 С аланинамино- CH 3 аланин трансфераза пировиноградная CH 2 кислота CH 2 COOH COOH -кетоглутаровая глутаминовая кислота кислота фосфотрансферазы перенос фосфатных групп. Перенос фосфатных групп с АТФ на субстрат или с субстрата на АДФ осуществляют ферменты ки- назы (например, гексокиназа переносит фосфатную группу с АТФ на глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата в процессе гликолиза. 7 Гидролазы участвуют в расщеплении внутримолекулярных связей (кроме С С ) в органических веществах гидролитическим путем, тес участием воды. Важное место среди ферментов этого класса занимают пищеварительные ферменты, участвующие в переваривании липидов(липазы), белков (пептидазы) и углеводов (гликозодазы). Липазы, относящиеся к подклассу эстераз, осуществляют гидролиз сложноэфирных связей осуществляют в молекулах триацилглицеринов: CH 2 О С СНОС СНОС С 15 Н 31 + 3 H 2 О трипальмитоилглицерин O || || || O O CH 2 ОН CH ОН CH 2 ОН глицерин || O + С 15 Н 31 С ОН 3 пальмитиновая кислота В данном случае расщепляются сложноэфирные связи, образованные спиртом и карбоновыми кислотами такой гидролиз осуществляют карбоксиэ- стеразы. К классу гидролаз относятся гликозидазы Они расщепляют гликозидные связи в молекулах ди- и полисахаридов. Например, сахараза расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу, амилаза расщепляет крахмал до мальтозы. Ферменты пептидазы осуществляют гидролиз пептидных связей в молекулах белков и пептидов O O O O || || + H 2 O || || H 2 N CH C N CH C OH R 1 CH C OH + R 1 CH C OH дипептидаза R 1 H R 2 NH 2 дипептид аминокислоты Эндопептидазы расщепляют пептидные связи внутри молекул (например, пепсин. Экзопептидазы делятся на карбоксипептидазы (расщепляют пептидные связи с С-конца цепи) и аминопептидазы (расщепляют пептидные связи с конца цепи. Лиазы расщепляют внутримолекулярные связи в органических веществах включая С С ) не гидролитическим путем, а также катализируют реакции присоединения группировок по месту разрыва двойных связей. 8 Примеры O O || || СОН С Н C= O пируват- CH 3 декарбоксилаза CH 3 CO 2 уксусный пировиноградная альдегид кислота CООH СООH C H HO C H || + НО H C CH 2 фумарат- О гидратаза СООН фумаровая яблочная кислота кислота Изомеразы катализируют реакции взаимопревращения изомеров. Пример O || C H С H C OH триозофосфат- C = O изомераза CH 2 – OРО 3 Н 2 ОН глицеральдегид-3-фосфат дигидроксиацетонфосфат Ферменты класса лигаз катализируют реакции присоединения х молекул друг к другу сопряженное с разрывом пирофосфатной связи в молекуле АТФ или ее аналогов, те. они осуществляют синтез сложного вещества из более простых с использованием энергии АТФ или ее аналогов. 9 Пример О + АТФ, + СО О C = O пируваткарбоксилаза C = O АДФ CH 3 Н 3 РО 4 С пировиноградная кислота О щавелево-уксусная кислота Химическая природа ферментов Простые и сложные ферменты. Кофакторы и их роль в процессе катализа По химической природе ферменты являются белками и подразделяются на простые и сложные. Простые ферменты при гидролизе расщепляются до аминокислот. Примеры простых ферментов трипсин, уреаза, рибонуклеаза. Большинство природных ферментов относится к сложным белкам, содержащим кроме белкового компонента, называемого апоферментом, и небелковую часть - кофактор. Апофермент и кофактор отдельно друг от друга не могут обеспечивать катализ химической реакции. Объединение их дает активную молекулу фермента - холофермент. Кофакторы могут быть неорганической природы (представлены ионами металлов Zn 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , Cu 2+ и др) и органической природы (коферменты, которые в большинстве случаев в своей структуре содержат остатки водорастворимых витаминов, например тиаминпирофосфат содержит остаток витамина В, флавинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид остаток витамина В, кофермент ацилирования остаток витамина В, никотинамидадениндинуклеотид и никотинамидадениндинуклеотидфосфат остаток витамина В, пиридок- сальфосфат остаток витамина В. Кофакторы в процессе катализа выполняют следующие функции изменяют трехмерную структуру фермента или субстрата для улучшения взаимодействия между ними многие из них служат основой для формирования активного центра фермента участвуют в процессе переноса протонов, электронов, атомов и атомных групп могут выступать в реакции в роли дополнительного субстрата. 10 3.2. Мономерные и олигомерные ферменты. Изоферменты и их роль в диагностике различных заболеваний В зависимости от строения ферменты делятся на мономерные и олигомерные Мономерные ферменты (например, рибонуклеаза, трипсин) содержат одну полипептидную цепь и имеют первичную, вторичную и третичную структуры. Олигомерные ферменты содержат 2 и более полипептидных цепей (субъединиц) и имеют помимо вышеуказанных и четвертичную структуру. Чаще всего встречаются олигомерные ферменты счетным числом субъединиц (лактат- дегидрогеназа 4, уреаза 8). Если различные олигомерные ферменты катализируют разные, но взаимосвязанные между собой реакции, то они образуют мультиферментный комплекс (например, пируватдегидрогеназный комплекс содержит 3 фермента - пируватдегидрогеназу, дигидролипоилдегидрогеназу, дигидролипоилтрансаце- тилазу, катализирующие связанные между собой реакции в процессе аэробного окисления пировиноградной кислоты. Изоферменты это разновидности одного итого же олигомерного фермента, катализирующие одну и туже реакцию, но различающиеся между собой физическими и химическими свойствами. Одним из наиболее изученных олигомерных ферментов является лактат- дегидрогеназа (ЛДГ), представляющий собой тетрамер (те. состоящий из х субъединиц. ЛДГ катализирует обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. ЛДГ существует в виде 5 изоферментов, которые образуются в результате различного сочетания субъединиц х типов H (сердечного) и М (мышечного ЛДГ 1 Н ЛДГ 2 Н 3 М; ЛДГ 3 Н 2 М 2 ; ЛДГ 4 НМ ЛДГ 5 – М Рисунок 1 Изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в различных органах Для каждого органа, ткани, биологической жидкости характерен свой изоферментный спектр (рисунок 1), те. определенное содержание и соотношение изоферментов, что связано с направленностью обмена веществ в этих органах и тканях. Например, ЛДГ 1 преобладает в сердечной мышце, а ЛДГ 5 - в печени. Изучение картины изоферментного спектра широко используется в клинической диагностике, что позволяет определить характер патологического процесса, а также контролировать ход лечения. Так, при инфаркте миокарда в плазме крови будут преобладать изоферменты ЛДГ с Н-типом субъединица при воспалительных процессах печени М-типа. Общие закономерности строения активных центов ферментов Активный центр фермента это участок фермента, который специфически взаимодействует с субстратом ив котором осуществляется процесс катализа химической реакции. На активный центр приходится относительно малая доля общего объема фермента, большая часть аминокислотных остатков в молекуле фермента не контактирует с субстратом. Активный центр представляет собой трехмерное образование, пространственная структура его стереохимически комплементар- на субстрату (рисунок 2), предопределяя природу химических превращений. Активный центр фермента специфически связывается с субстратом, что обусловлено строго определенным расположением аминокислотных остатков и их функциональных групп, называемых каталитическими. Рисунок 2 Взаимодействие субстрата с ферментом согласно модели «ключ-замок» (активный центр фермента комплементарен субстрату) Активные центры некоторых ферментов представляет собой нежесткую структуру, а форма его становится комплементарной форме субстрата только после связывания этого субстрата (рисунок 3). Этот процесс называется индукцией соответствия. 12 Рисунок 3 Взаимодействие субстрата с ферментом согласно модели индуцированного соответствия 3.4. Аллостерический центр фермента и его роль в процессе катализа Помимо активного центра в молекуле многих ферментов имеется алло- стерический (регуляторный) фермент. С ним связываются аллостерические эффекторы. Положительные эффекторы переводят фермент в активное состояние и называются активаторами отрицательные в неактивное и называются ингибиторами. В роли эффекторов выступают гормоны, субстраты, продукты реакции, коферменты. Основные свойства ферментов Ферменты обладают высокой каталитической активностью, ускоряя химические реакции в миллионы раз Так фермент карбоангидраза за 1 секунду способен гидратировать 10 5 молекул СО. Скорость этой реакции в отсутствии фермента враз ниже. Активность фермента можно определить по скорости убыли субстрата или по интенсивности образования продукта реакции. В 1972 году Международным биохимическим союзом была предложена единица активности фермента катал. Катал это такое количество фермента, которое катализирует превращение моль субстрата (S) или образование 1 моль продукта реакции (P) засек. В практике активность фермента чаще выражается в милликаталах (мкат), мик- рокаталах (мккат) и нанакаталах (нкат). Употребляется также и интернациональная единица активности фермента ЕЕ это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата или получение 1 мкмоль продукта реакции за 1 мин. 1 Е = 16,67 нкат. Для выражения активности ферментов употребляется также удельная и молекулярная активность. 13 Удельная активность это число единиц активности фермента в расчете на 1 мг белка. Молекулярная активность это число молекул субстрата, превращенное 1 молекулой фермента за 1 мин. Ферменты ускоряют наступление химического равновесия, катализируют как прямую, таки обратную реакцию. Ферменты проявляют высокую специфичность действия в отношении катализируемой реакции и субстрата. Фермент катализирует строго определенную химическую реакцию или несколько очень сходных химических реакций. Если фермент катализирует превращение только одного субстрата, то он обладает абсолютной специфичностью (например, уреаза расщепляет только мочевину. Если же фермент действует на несколько сходных построению субстратов, то он обладает относительной специфичностью (например, алкоголь- дегидрогеназа катализирует окисление одноатомных спиртов, а фермент пепсин расщепляет определенные пептидные связи в белках как растительного, таки животного происхождения. Активность ферментов регулируется. Ряд ферментов синтезируется в неактивной форме и переходит в активное состояние в физиологически соответствующем месте и времени. Например, неактивный трипсиноген, образующийся в поджелудочной железе, активируется в тонком кишечнике в результате отщепления гексапептида. Ферменты осуществляют трансформацию различных видов энергии. Например, при фотосинтезе энергия света превращается в химическую энергию. При мышечном сокращении энергия АТФ превращается в механическую энергию. Механизм действия ферментов Вероятность протекания химической реакции определяется разницей между свободной энергией исходных веществ и продуктов реакции. Если она больше у исходных веществ, то возможно самопроизвольное течение реакции. Скорость ее зависит от энергетического барьера, который необходимо преодолеть реагирующим веществам, причем высота его неодинакова для разных реакций. Энергетический барьер это разница между средней энергией реагирующих молекул и минимальной энергией, необходимой для протекания химической реакции. Кинетическая энергия реакционно-способных молекул достаточна для преодоления энергетического барьера, однако в обычных условиях лишь небольшая доля молекул обладает такой энергией. Для преодоления этого барьера молекулам вещества нужно сообщить какое-то количество энергии Дополнительное количество энергии, которое нужно сообщить молекулам 1 моль вещества для перевода их в реакционно-способное состояние приданной температуре, называется энергией активации. Во всякой химической реакции существует переходное состояние, которое характеризуется высокой свободной энергией и определяется как состояние взаимодействующих молекул, соответствующее вершине энергетического барьера. Чем выше энергия активации, тем выше высота энергетического барьера и тем ниже скорость реакции Скорость реакции пропорциональна концентрации молекул в переходном состоянии. Связывание реагирующих веществ с катализатором приводит к появлению нового переходного состояния, характеризующегося меньшей энергией активации по сравнению с переходным состоянием не катализируемой реакции рисунок 4). Рисунок 4 Энергетический барьер некатализируемой и катализируемой реакций Ферменты и небиологические катализаторы, подчиняясь общим законам катализа, имеют следующие общие признаки они катализируют только энергетически возможные реакции не изменяют направления реакции ускоряют наступление равновесия обратимой реакции и не сдвигают его не расходуются в процессе реакции. Однако ферменты обладают особыми качествами, отличающими их от не- биологических катализаторов.Эти отличия связаны с особенностями строения ферментов, как веществ белковой природы: скорость ферментативного катализа намного выше, чем небиологиче- ского, так как ферменты сильнее снижают энергию активации. Так, например, энергия активации реакции разложения пероксида водорода без катализатора составляет 75,6 кДж/моль, с участием катализатора платины 49,14 кДж/моль, ас участием фермента каталазы 23,1 кДж/моль; ферменты обладают высокой специфичностью действия ферменты катализируют реакции в мягких условиях, те. при обычном давлении, температуре тела и рН, близкому к нейтральной среде, в то время как небиологические катализаторы действуют при высоком давлении, температуре и крайних значениях рН; активность ферментов регулируется, что позволяет изменять скорость превращения веществ в организме, те. приспосабливаться к действию различных факторов скорость ферментативной реакции прямопропорциональна количеству фермента, тогда как для небиологического катализатора не существует строгой зависимости скорости реакции от количества катализатора, поэтому недостаток фермента означает низкую скорость превращения вещества в организме и наоборот, одним из путей приспособления клеток организма является образование дополнительных количеств фермента. Стадии ферментативного катализа Большую роль в развитии представлений о механизме действия ферментов сыграли классические работы Л. Михаэлиса и М. Ментен, развивших положение о фермент-субстратных комплексах. Процесс ферментативного катализа можно описать следующей схемой I II III E + S ES EZ EP E + P На й стадии, обычно непродолжительной повремени, происходит связывание субстрата с активным центром фермента с образованием фермент- субстратного комплекса ES. На этой стадии изменение энергии активации незначительно (рисунок 5). Рисунок 5 Энергетическая схема ферментативной реакции. В точках 1 и 2 имеются малые энергетические барьеры Вторая стадии лимитирует скорость всего катализа. Она наиболее медленная и длительность её зависит от энергии активации данной химической 16 реакции На этой стадии происходит расшатывание связей субстрата , их разрыв и образование новых связей . Благодаря образованию активированных переходных комплексов EZ снижается энергия активации субстрата. я стадия, как и я, непродолжительна повремени, на ней осуществляется отделение продукта реакции от активного центра фермента. Кинетика ферментативных реакций Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (фермента и субстрата, условий их взаимодействия (концентрации веществ, рН среды, температуры, влияния активаторов и ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям, однако при изучении кинетики последних следует учитывать одну важную особенность этих реакций явление насыщение фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата это реакция го порядка (рисунок 6, участок а. Рисунок 6 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента Реакция смешанного порядка (участок б) характеризуется постепенным снижением роста скорости реакции при дальнейшем увеличении концентрации субстрата. Наконец, при определенной концентрации субстрата, скорость реакции достигает максимума и не зависит от концентрации субстрата (участок в графика) реакция нулевого порядка. В этом случае происходит полное насыщение активного центра фермента субстратом и скорость реакции зависит только от концентрации фермента. Математическое выражение зависимости скорости реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса-Ментен: V= S Km S V max ; где Vmax максимальная скорость реакции Km константа Михаэлиса 17 Константа Михаэлиса показывает концентрацию субстрата при которой скорость реакции равна половине максимальной. Чем выше константа Михаэлиса, тем ниже сродство фермента к субстрату и наоборот. Так, гексокиназа имеет более высокое сродство к глюкозе, чем глюкоки- наза и работает при невысоких концентрациях глюкозы. Фермент глюкокиназа работает при больших концентрациях глюкозы, имея невысокое сродство к глюкозе. 6. Регуляция ферментативной активности Регуляция скорости ферментативного катализа осуществляется 2-мя способами 1) количеством фермента на уровне его биосинтеза) активностью фермента. Существуют следующие пути регуляции активности ферментов ковалентная модификация ассоциация и диссоциация ингибирование аллостерическая регуляция влияние рН и температуры. Ковалентная модификация заключается в присоединении к определенной части молекулы фермента или отщеплении от нее какой-либо группировки, что приводит к изменению активности фермента. Наиболее распространенными видами ковалентной модификации являются фосфорилирование и дефосфори- лирование. При фосфорилировании происходит перенос фосфатной группы с АТФ на определенный остаток серина или треонина в молекуле фермента, этот процесс катализируют фосфопротеинкиназы (рисунок 7). Дефосфорилирование сопровождается отщеплением фосфатной группы от молекулы фермента при участии фосфопротеинфосфатаз. Рисунок 7 Фосфорилирование и дефосфорилирование ферментов Входе этих процессов изменяется активность ферментов. 18 Пример гликогенфосфорилаза, участвующая в расщеплении гликогена, активна только в фосфорилированной форме, а гликогенсинтаза, принимающая участие в синтезе гликогена, активируется путем дефосфорилирования. Разновидностью ковалентной модификации является регуляция активности ферментов на уровне профермента. Ряд ферментов синтезируется в неактивной форме, в виде профермента, переходящего в активное состояние в соответствующем месте и времени. Примером регуляции такого типа могут служить пищеварительные ферменты. Например, трипсиноген, синтезирующийся в поджелудочной железе, активируется в тонком отделе кишечника в результате отщепления гексапептида с образованием активной формы трипсина (рисунок Рисунок 8 Активация профермента путем гидролиза специфических пептидных связей Такой же тип регуляции используется в последовательности ферментативных реакций, ведущих к свертыванию крови. Ассоциация и диссоциация характерны для олигомерных ферментов имеющих 2 и более субъединиц. Ассоциация субъединиц чаще всего приводит к активации фермента, а диссоциация олигомерного фермента на отдельные субъединицы в большинстве случаев ведет к потере ферментом активности. Часто ассоциация и диссоциация связаны с процессами фосфорилирования и дефосфорилирования. Пример фосфорилирование каждой из субъединиц гликогенфосфорилазы способствует их ассоциации с образованием активного тетрамерного фермента. Процесс торможения ферментативной активности называется ингибированием, а вещества его вызывающие - ингибиторами. В зависимости от характера связывания фермента с ингибитором различают обратимое и необратимое ингибирование. Обратимое ингибирование делится на конкурентное и неконкурентное. При конкурентном ингибировании ингибитор, будучи близким по химической структуре с субстратом, конкурирует с ним за связывание с активным центром фермента (рисунок 9). 19 Рисунок 9 Схема конкурентного ингибирования. Конкурентный ингибитор препятствует связыванию фермента с субстратом При более высокой концентрации ингибитора образуется фермент- ингибиторный комплекс (E+I EI), не дающий продукта реакции. Тройной (фермент-ингибитор-субстрат) комплекс образоваться не может, так как и субстрат и ингибитор конкурируют между собой за один и тот же участок фермента, те. его активный центр. Конкурентное ингибирование преодолевается повышением концентрации субстрата. В этом случае происходит взаимодействие фермента и субстрата с образованием продукта реакции (E+S = ES E + P). Классическим примером конкурентного ингибирования является игиби- рование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой COOH COOH CH 2 C H || CH 2 сукцинатдегидрогеназа H C COOH COOH янтарная кислота фумаровая кислота субстрат) (продукт реакции) COOH реакция не идет COOH малоновая кислота (ингибитор) На принципе конкурентного ингибирования основано действие многих фармакологических препаратов Например, для лечения некоторых инфекционных заболеваний применяют сульфаниламидные препараты, имеющие структурное сходство с пара- аминобензойной кислотой, которую бактерии используют для синтеза фолиевой кислоты 20 пара-аминобензойная сульфаниламид кислота (ПАБК) Применение сульфаниламидных препаратов ингибирует фермент, синтезирующий фолиевую кислоту (путем вытеснения ПАБК), что ведет к торможению роста бактерий. При неконкурентном ингибировании действие ингибитора не преодолевается повышением концентрации субстрата. Ингибитор не имеет структурного сходства с субстратом и связывается либо непосредственно с каталитическими группами активного центра фермента (рисунок 10) или с другим участком фермента, изменяя конформацию активного центра таким образом, что затрагивает структуру каталитического участка, мешая его взаимодействию с субстратом (рисунок 11). Поскольку неконкурентное ингибирование не влияет на связывание субстрата, тов отличие от конкурентного ингибирования наблюдается образование тройного комплекса (E + I + S EIS), однако продукта реакции он не дает. Примерами неконкурентных ингибиторов являются ионы ртути, кадмия, мышьяка, свинца и их органические соединения. Эти ионы блокируют функциональные группы (например, SH группы) каталитического участка фермента. Комплекс фермент-ингибитор может присоединять субстрат, но превращения последнего не происходит, так как каталитические группы активного центра фермента заблокированы. Снять действие неконкурентного ингибитора можно веществами, связывающими этот ингибитор (рисунок 12). Примерами неконкурентных ингибиторов являются ионы ртути, кадмия, мышьяка, свинца и их органические соединения. Эти ионы блокируют, например -SH группы каталитического участка фермента. Комплекс фермент-ингибитор может присоединять субстрат, но превращения последнего не происходит, так как каталитические группы активного центра фермента заблокированы. Неконкурентные ингибиторы применяются в качестве фармакологических средств Препараты, содержащие ртуть, мышьяк, висмут неконкурентно ингибируют ферменты в клетках организма или болезнетворных бактерий, чем и определяется их лечебный эффект. При интоксикации вытеснение ингибитора, являющегося ядом, возможно с помощью реактиваторов или противоядий. К ним относятся тиолсодержа- щие соединения, лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота. 21 фермент субстрат иингибитор Рисунок 10 – Связывание ингибитора (Hg 2+ ) с каталитическими группами ( SH) активного центра фермента Рисунок 11 – Связывание неконкурентного ингибитора с ферментом вне активного центра 22 S S Hg 2+ фермент-ингибитор-субстратный комплекс реактиватор HS HS + SН SН Hg 2+ реактиватор S S + фермент-субстратный комплекс комплекс реактиватор-ингибитор Рисунок 12 Снятие действия неконкурентного ингибитора (Hg 2+ ) с помощью реактиватора При необратимом ингибировании ингибитор необратимо связывается с ферментом (E + I EI). Примером такого ингибирования является связывание пенициллина с ферментом, участвующим в синтезе клеточных стенок бактерий. Важное место в регуляции обмена веществ принадлежит аллостерической регуляции, характерной для аллостерических ферментов. Эти ферменты помимо активного имеют также аллостерический центр, с которым связываются положительные или отрицательные аллостерические эффекторы. В качестве эффекторов могут выступать гормоны, различные метаболиты, ионы металлов, коферменты, иногда молекулы субстратов Аллостерические эффекторы влияют на конформацию активного центра фермента положительные изменяют ее таким образом, что активный центр фермента взаимодействует с субстратом и осуществляет катализ химической реакции (рисунок 13), а отрицательные действуют противоположным образом, переводя фермент в неактивное состояние рисунок 14). 23 Рисунок 13 – Активация фермента положительным эффектором Рисунок 14 Перевод фермента в неактивное состояние при помощи отрицательного аллостерического эффектора (ингибитора) Аллостерические ферменты занимают ключевое положение в метаболизме, поскольку тонко реагируют на изменения в обмене веществ и регулируют скорость прохождения веществ по целой системе ферментов. Исходное вещество (А) превращается в конечное (Е) через промежуточные В, С, D) под действием соответственно ферментов ЕЕ, ЕЕ (рисунок 15) Рисунок 15 Схема аллостерической регуляции активности фермента конечным продуктом метаболического пути Вещество К конечный метаболит этого пути, накапливаясь в больших количествах (превышающих потребности в нем клеток, ингибирует первый фермент Е этого пути, являющийся аллостерическим. Это аллостерическая регуляция по принципу обратной связи. Для каждого фермента существует свой оптимум рН таблица, при котором скорость катализируемой им реакции максимальна. Для большинства ферментов оптимум рН близок к нейтральному, хотя имеются ферменты, функционирующие при других значениях рН. 24 Таблица – Оптимальные значения р для некоторых ферментов Фермент pH Фермент pH Пепсин 1,5-2,5 Уреаза 7,0-7,2 Сахараза кишечника 5,8-6,2 Липаза панкреатина 7,0-8,5 Амилаза слюны 6,8-7,0 Трипсин 7,5-8,5 Каталаза 6,8-7,0 Аргиназа 9,5-10,0 Изменение рН среды влияет на ионизацию кислотных ( СООН) и основных имидазольного кольца гистидина) групп аминокислотных остатков активного центра фермента, что сопровождается изменением активности фермента. При оптимуме рН функциональные группы фермента и субстрата находятся в наиболее реакционно-способном состоянии. Знание оптимумов рН ферментов имеет важное значение для практической медицины Например, пепсин, расщепляющий пептидные связи в белках, функционирует в сильнокислой среде, поэтому для восстановления нарушенной активности эндогенного пепсина применят препарат пепсина с соляной кислотой, создающей нужный рН. Оптимумом температур для большинства ферментов является температура тела о С (рисунок 16). Более высокие температуры приводят к денатурации ферментов, так как по химической природе они являются белками. Рисунок 16 Зависимость скорости ферментативной реакции о температуры Влияние температуры на активность ферментов имеет существенное значение для понимания процессов жизнедеятельности. При понижении температуры скорость ферментативных реакций снижается, в результате снижается активность клеточных функций. Повышение температуры тела, например при инфекционных заболеваниях, ускоряет химические реакции в организме, что влечет за собой расточительное использование эндогенных субстратов в клетках больного организма. Термозависимость ферментов широко используется в практике (искусственное охлаждение организма при проведении хирургических операций хранение спермы, необходимой для искусственного осеменения с.-х. животных, осуществляется при температуре о С сохранность пищевых продуктов при низких температурах является результатом низкой активности ферментов микроорганизмов, способных вызвать порчу этих продуктов. Список литературы Основная 1. Березов, Т.Т. Биологическая химия учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коров- кин. – М Медицина, 1998. – 704 с. 2. Биологическая химия учебник / В.К. Кухта и др под ред. АД. Тага- новича. – Минск Асар, М Изд-во БИНОМ, 2008. – 688 с. 3. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия учебник / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызи- на. – е изд. – М Высшая школа, 2000. – 479 с. 4. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, КГ. Рём; пер. Л.В. Козлова, Е.С. Левиной, П.Д. Решетова; под ред. П.Д. Решетова, Т.И. Сороки- ной. – М Мир, 2000. – 448 с. 5. Михайлов, С.С. Спортивная биохимия учебник для вузов и колледжей физической культуры / С.С. Михайлов. – е изд. – М Советский спорт, 2004. – 220 с. 6. Николаев, А.Я. Биологическая химия учебник / А.Я. Николаев. – М Мед. информ. агенство, 2004. – 566 с. 7. Проскурина, ИК. Биохимия учеб. пособие / ИК. Проскурина. – Минск ВЛАДОС ПРЕСС, 2004. – 236 с. 8. Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии учебник / Ю.Б. Филипповиче изд. – М Агар, 1999. – 512 с. Дополнительная 9. Биохимия учебник / Т.Л. Алейникова и др под ред. Е.С. Северина. – М ГЭТАР-Медиа, 2007. – 784 с. 10. Биохимия человека в 2 т. / Р. Марии др пер. В.В. Борисова и Е.В. Дайниченко; под ред. Л.М. Гинодмана. – М Мир, 1993. Т. 1. – 384 с. 11. Тюкавкина, НА. Биоорганическая химия учебник / НА. Тюкавкина, Ю.И. Бауков. – е изд. – М Дрофа, 2005. – 542 с. 12. Чиркин А.А. Практикум по биохимии учеб. пособие / А.А. Чиркин. – Минск Новое знание, 2002. – 512 с. 13. Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот; пер. О.В. Добрыниной и др под ред. АИ. Арчакова и др. – М МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002. – 446 с. |