Антибиотики. Природные и синтетические. История открытия природных антибиотиков. Классификация антибиотиков по химической структуре, механизму, спектру и типу действия. Способы получения

• Название: Антибиотики. Природные и синтетические. История открытия природных антибиотиков. Классификация антибиотиков по химической структуре, механизму, спектру и типу действия. Способы получения
• Анкор: ekzamen_mikra_docx-1873179788.docx
• Дата: 26.04.2017
• Размер: 163.53 Kb.
• Имя файла: ekzamen_mikra_docx-1873179788.docx
• Тип: Документы; #5488
• страница: 4 из 14

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Люминесцентный метод микроскопии занимает важное место в исследовании микроорганизмов. Люминесценцией (или флюоресценцией) называют излучение клеткой света за счет поглощенной энергии. Только немногие бактерии (люминесцирующие) способны светиться собственным светом в результате интенсивных процессов окисления, протекающих у них со значительным выделением энергии.

Большинство микроорганизмов приобретает способность люминесцировать, или флюоресцировать, при освещении их ультрафиолетовыми лучами после предварительной окраски специальными красителями — флюорохромами. Поглощая короткие ультрафиолетовые волны, объект излучает более длинные волны видимой части спектра. Вследствие этого разрешающая способность микроскопа повышается. Это дает возможность исследовать более мелкие частицы. Чаще используют красители- флюорохромы: акридин оранжевый, аурамин, корифосфин, флюоресцеин в виде очень слабых водных растворов.

При окраске корифосфином коринебактерии дифтерии дают желто-зеленое свечение в ультрафиолетовом свете, микобактерии туберкулеза при окраске аурамин-родамином — золотисто-оранжевое. Для успешной микроскопии необходим яркий источник света, в качестве которого используют ртутно-кварцевую лампу высокого давления. Между источником света и зеркалом помещают сине-фиолетовый светофильтр, который пропускает только короткие и средние волны ультрафиолетового света. Попав на объектив, эти волны возбуждают в нем люминесценцию. Чтобы увидеть ее, на окуляр микроскопа надевают желтый фильтр, который пропускает длинноволновый свет флюоресценции, возникающий при прохождении лучей через объект. Короткие волны, не поглощенные исследуемым объектом, убираются, отсекаются этим фильтром.

Существуют специальные люминесцирующие микроскопы МЛ-1, МЛ-2, MЛ-3, а также простые устройства: комплект ОИ-17 (опакиллюминатор), ОИ-18 (осветительное устройство с ртутно-кварцевой лампой СВД-120А), дающие возможность применять для люминесцентной микроскопии обычный биологический микроскоп.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. Исследование микроорганизмов в темном поле (темнопольная микроскопия) основано на явлениях рассеяния света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц. Микроскопия в темном поле зрения позволяет увидеть более мелкие частицы, чем в световом микроскопе. Она осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, снабженного специальными конденсорами (параболоид- или кардиоид-конденсор), который создает полый конус света. Вершина этого полого конуса совпадает с объектом. Лучи света, проходя через  объект исследования в косом направлении, не попадают в объектив микроскопа. В него проникает только свет, рассеянный объектом. Поэтому на темном фоне препарата наблюдаются ярко светящиеся контуры микробных клеток и других частиц. Микроскопия в .темном поле зрения позволяет определить форму микроба и его подвижность. Обычно темнопольную микроскопию используют при исследовании микроорганизмов, которые слабо поглощают свет и не видны в световом микроскопе, как, например, спирохеты. Для создания темного поля можно также использовать обычный конденсор Аббе, поместив в центр его кружок черной бумаги. В этом случае свет устанавливают и центрируют по световому полю, а затем затемняют конденсор Аббе.
Препарат для микроскопии готовят по методу раздавленной капли. Толщина предметного стекла не должна превышать 1 — 1,1 мм, иначе фокус конденсора придется в толщу стекла. Между конденсором и предметным стеклом помещают жидкость (дистиллированная вода) с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. При правильной установке освещения на темном поле видны яркие светящиеся точки.

Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. Глаз человека может улавливать изменения длины волны и интенсивности видимого света только при исследовании непрозрачных объектов, проходя через которые, световые волны равномерно или неравномерно ослабляются, т. е. меняют величину амплитуды. Такие объекты называются амплитудными. Обычно это фиксированные и окрашенные препараты микроорганизмов или срезы тканей. Живые клетки вследствие высокого содержания в них воды слабо поглощают свет, поэтому почти все компоненты их прозрачны.

Метод фазово-контрастной микроскопии основан на том, что живые клетки и микроорганизмы, слабо поглощающие свет, тем не менее способны изменять фазу проходящих через них лучей (фазовые объекты). В разных участках клеток, отличающихся показателем преломления и толщиной, изменение фаз будет неодинаковым. Эти разности фаз, возникающие при прохождении видимого света через живые объекты, можно сделать видимыми с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Фазово-контрастная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа и специального приспособления, куда входят фазово-контрастный конденсор с кольцевыми диафрагмами и фазовая пластинка, имеющая форму кольца. Для первоначальной наводки используют вспомогательный микроскоп, с помощью которого добиваются того, чтобы через кольцевую диафрагму конденсора в объектив проникало лишь кольцо света. Луч света, пройдя через прозрачный объект, расщепляется на два луча: прямой и дифрагированный (преломленный). Прямой луч, проникнув через частицу, фокусируется на кольце фазовой пластинки, а дифрагированный луч как бы огибает частицу, не проходя через нее. Поэтому оптические пути их различны и между ними создается разность фаз. Она сильно увеличивается с помощью фазовой пластинки и благодаря этому контрастность изображения повышается, что позволяет наблюдать не только фазовые объекты целиком, но и детали строения, например, живых клеток и микроорганизмов.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.

16. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:

• Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков - качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

• Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.

Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10⁶-10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.  К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом - исследуемой жидкости.  Затем  в каждую  пробирку вносят   взвесь  тест-бактерий,  приготовленную   в   среде  Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина,   тетрациклинов,   эритромицина   в  качестве  тест-бактерий используют  стандартный  штамм  S. aureus, а  при  определении стрептомицина - Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18-20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы   тест-бактериями.   Концентрация   антибиотика  определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости,   задерживающей   рост  тест-бактерий,  на   минимальную концентрацию   эталонного  антибиотика,   задерживающего   рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024,  а   минимальная концентрация  эталонного  антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение  1024х0,313=320 мкг/мл составляет  концентрацию антибиотика в 1 мл.

Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).
17. Механизмы передачи генетического материала у бактерий.

Конъюгация бактерий состоит в переходе генетического материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клетку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.

«Мужская» клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержащие F-фактора, являются «женскими»; при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фактора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контролирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F⁺; они передают F-фактор клеткам, обозначаемым F^- («женским»), не утрачивая донорской способности, так как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ. high frequency of recombination — высокая частота рекомбинаций), т.е. бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F^- хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клетку F^-, продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 мин.

Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента — происходит гомологичная рекомбинация. Прерывая процесс конъюгации бактерий, можно определять последовательность расположения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выходе из хромосомы захватывать небольшую ее часть, образуя так называемый замещенный фактор — F'.

При конъюгации происходит только частичный перенос генетического материала, поэтому ее не следует отождествлять полностью с половым процессом у других организмов.

Трансдукция — передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую — перенос определенного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включением ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая трансдукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привносятся новые гены, и ДНК фага в виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается лизогенией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе соответствующего продукта, такая трансдукция называется абортивной.

Трансформация заключается в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной растворимой форме, передается бактерии-реципиенту. При трансформации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий родственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологичных участков собственной и проникшей извне ДНК. Впервые явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил мышам живой невирулентный бескапсульный R-штамм пневмококка и одновременно убитый вирулентный капсульный S-штамм пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулентный пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пневмококка. Таким образом, убитый S-штамм пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пневмококка. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) доказали, что трансформирующим агентом в этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов.

Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального субстрата наследственности. При изучении генетической трансформации у бактерий были разработаны методы экстракции и очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.

18. Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Пути ее преодоления. Антибиотикорезистентность — это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.