Дипломная работа химические методы стандартизации сердечных гликозидов. ПОИСК ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬ. башкирский государственный медицинский университет министерства здравоохранения российской федерации кашфуллина камилла ильдаровна
 Скачать 2.35 Mb.
|
|
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Объекты исследования Объектами исследования стали высушенные листья Ландыша майского листья и Горицвета весеннего трава, заготовленные в период цветения в 2020-2021 годах на территории Республики Башкортостан. Convallaria majalis L. (Ландыш майский) Adonis vernalis L. (Горицвет весенний) В качестве стандартных образцов послужили препараты «Адонис-бром», «Коргликард», «Капли Зеленина». Методы анализа, используемые для качественного определения сердечных гликозидов 2.2.1 Качественные реакции, проводимые для ЛРС Горицвета весеннего. 1 мл раствора А или 1 мл раствора Б, приготовленных для испытания по показателю «Биологическая активность», разбавляют 2 мл воды. К 1 мл полученного раствора прибавляют 2 капли натрия нитропруссида раствора 0,5 % и 3 капли натрия гидроксида раствора 10 %; должно наблюдаться коричневато-жёлтое окрашивание, которое затем переходит в жёлтое (сердечные гликозиды). [1] К 1 капле раствора А или раствора Б прибавляют 8 капель серной кислоты концентрированной; должно наблюдаться темно-красное окрашивание (сердечные гликозиды).[1] 2.2.2 Качественные реакции, проводимые для ЛРС Ландыша майского. К 3 мл элюата (см. раздел «Количественное определение»), прибавляют 2,5 мл натрия пикрата нейтрального раствора и 0,5 мл натрия гидроксидараствора 2 %, через 10 мин появляется оранжево-желтое окрашивание (гликозиды). [2] Тонкослойная хроматография. Около 2,0 г листьев, травы или цветков ландыша, измельчённых до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в круглодонную колбу и прибавляют 60 мл спирта 70 %. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане в течение 1 ч, после охлаждения извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. К шроту прибавляют 40 мл спирта 70 %, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане в течение 30 мин, после охлаждения раствор фильтруют в ту же мерную колбу, объем раствора доводят тем же спиртом до метки и перемешивают. 10 мл раствора упаривают на водяной бане, сухой остаток растворяют в 3 мл спирта 70 %. Объем раствора доводят водой до 10 мл, прибавляют 1 мл свинца (II)ацетата раствора 10 % и перемешивают (раствор А). Полученный раствор А фильтруют в делительную воронку через бумажный фильтр, предварительно смоченный водой. Фильтр промывают 5 мл воды, прибавляют 30 мл смеси хлороформ – спирт 96 % (8:2) и извлекают в течение 5 мин. После разделения слоёв хлороформный нижний слой фильтруют через бумажный фильтр, содержащий 3 г натрия сульфата безводного, смоченного 5 мл хлороформно-спиртовой смеси, в фарфоровую чашку. Операцию извлечения хлороформно-спиртовой смесью повторяют ещё дважды, используя по 25 мл этой смеси. Хлороформное извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же фарфоровую чашку, фильтр промывают 10 мл хлороформно-спиртовой смеси (8:2). Объединённое хлороформное извлечение выпаривают на водяной бане досуха. Сухой остаток растворяют 2 мл спирта 70 % (раствор Б). На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля наносят 50 мкл раствора Б. Пластинку с нанесённой пробой сушат на воздухе, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение 1 ч смесью растворителей хлороформ – ацетон–метанол (6:2:2), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдёт около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, её вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей. Пластинку обрабатывают ванилина раствором 1 % в хлорной кислоте разведённой 10 % и выдерживают в сушильном шкафу при температуре 80-85 °С до чёткого обнаружения зон. На хроматограмме раствора Б должны обнаруживаться не менее 3 зон адсорбции малинового цвета; допускается обнаружение других зон адсорбции (гликозиды). [3] Методы анализа, используемые для количественного определения сердечных гликозидов. В ОФС.1.2.4.0009.15 ГФ XIV приведены биологические методы оценки активности сырья, содержащего сердечные гликозиды. Принцип метода биологической оценки Биологическая оценка указанных выше лекарственных средств основана на способности сердечных гликозидов в токсических дозах вызывать систолическую остановку сердца животных. Активность лекарственных средств, содержащих сердечные гликозиды, оценивают по сравнению с активностью стандартных образцов и выражают в единицах действия (ЕД). Испытания проводят на лягушках разных видов. Устанавливают наименьшие дозы стандартного образца и испытуемого лекарственного средства (испытуемого лекарственного растительного сырья/препарата), вызывающие систолическую остановку сердца подопытных животных. Затем рассчитывают содержание единиц действия в 1 г испытуемого лекарственного средства (ИЛС), если испытывается лекарственное растительное сырье или сухие концентраты; в одной таблетке − при испытании таблеток или в 1 мл, если испытываются жидкие лекарственные формы. [6] Сравнительная оценка методик идентификации сердечных гликозидов в лекарственном растительном сырье. [21] Согласно требованиям ГФ идентификация лекарственного растительного сырья проводится методами: макроскопии, микроскопии, идентификации биологически активных веществ (тонкослойная хроматография ТСХ, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ и качественные реакции). Фармакопейный анализ показал, что сердечные гликозиды как биологически активные вещества идентифицируют при помощи ТСХ. Сравнительная оценка фармакопейных методик идентификации сердечных гликозидов методом ТСХ представлена в таблице 1. Таблица 1 – Сравнительный анализ фармакопейных методик идентификации сердечных гликозидов методом ТСХ
Из всех представленных в таблице 1 методик наиболее приемлемыми для дальнейших исследований, апробации и валидации, являются методики, описанные во Французской [26] и Немецкой гомеопатической фармакопеях [25] для лекарственного растительного сырья Adonis vernalis и Convallaria majalis. Возможна апробация и методики, описанной в Государственная Фармакопея Республики Беларусь [24], однако в качестве стандартного образца наиболее целесообразно исследовать цимарин и конваллятоксин. На основании представленных в таблице 1 методик для апробации выбраны 5, как наиболее оптимальные, в которых маркерами являются конваллятоксин и цимарин. Необходимо отметить, что в 4 из них подвижные фазы идентичны и пробоподготовка испытуемого раствора и раствора сравнения, система проявителей имеет схожие элементы и параметры. Методики для апробации будут иметь следующую интерпретацию, однако пробоподготовка, подвижная фаза, вид пластинки для хроматографии, фронт подвижной фазы, приготовление проявителя и описание хроматограммы будут соответствовать параметрам, представленным в таблице 1. Метод тонкослойной хроматографии [23] в следующей интерпретации: Испытуемый раствор. 1 г измельчённой субстанции добавляют в 20 мл спирта этилового (50%, об/об) Р и 10 мл раствора свинца (II) ацетата Р. Кипятят в течении 2 мин, охлаждают и центрифугируют. Надосадочную жидкость декантируют и перемешивают с 30 мл этилацетата Р и фильтруют. Фильтрат выпаривают досуха и растворяют в 1 мл смеси этилацетат Р метанол Р (50:50, об/об). Раствор сравнения. 5 мг СО ГФ РК конваллятоксина и 5 мг СО ГФ РК цимарина растворяют в 1 мл смеси этилацетат Р метанол Р (50:50, об/об). На линию старта ТСХ пластинки со слоем силикагеля Р наносят 20 мкл испытуемого раствора и 10 мкл раствора сравнения в виде полос. Пластинку помещают в камеру с системой растворителей вода Р метанол Р этилацетат Р (8:11:81, об/об/об). Когда фронт растворителей пройдет 10 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе, опрыскивают смесью раствора кислоты динитробензойной Р разбавленного раствора натрия гидроксида Р (50:50, об/об) и просматривают при дневном свете. На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться две жёлтые зоны между линей старта и конваллятоксина, фиолетовая зона (конваллятоксина), жёлтая зона над ней, на которую может накладываться слабая, едва отделённая фиолетовая зона, фиолетовая зона (цимарин) и жёлтая зона может присутствовать над цимарином. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||