Методы исследования в молекулярной биологии. Человечество вошло в третье тысячелетие с большим запасом знаний в области наук о жизни и колоссальным потенциалом их практического использования
 Скачать 53.91 Kb.
|
|
Введение Человечество вошло в третье тысячелетие с большим запасом знаний в области наук о жизни и колоссальным потенциалом их практического использования. молекулярный биология белок рибонуклеиновый Современный человек может произвольно и направленно изменять наследственность окружающего его живого мира - бактерий, растений, животных и человека. Появились беспрецедентные возможности технологического прогресса (биотехнология и биоинженерия), открывшего также новые пути в медицине (генная терапия) и сельском хозяйстве (трансгенные, или генетически модифицированные, растения и животные). Все это возникло на базе революционных прорывов в фундаментальной науке (молекулярная биология), которые затем и породили биотехнологическую революцию. Эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века стал предложенный в 1983 г. американским исследователем Кэрри Б. Мюллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г., альтернативный метод анализа геномной ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получить 100 млрд. сходных по структуре молекул и однозначно «увидеть» нужные участки, а затем проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации. «Эта реакция проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать может быть чистым, а может представлять собой сложную смесь различных биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и человеческий волос, и биоптат ткани, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии, и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте. За годы, прошедшие со времени открытия полимеразной цепной реакции, она нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция. Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже много назад все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны.» В данной работе я рассмотриваю механизм полимеразной цепной реакции (механизм амплификации ДНК в искусственных условиях), физические явления, лежащие в основе ПЦР – анализа (эффект Пельтье), а также важнейшие области применения полимеразной цепной реакции. Цель: Изучить методы молекулярной биологии. Задачи: Изучить этапы развития молекулярной биологии; Изучить исследования структур ДНК и РНК; Рассмотреть первые исследования структуры белка. Глава1. Методы исследования молекулярной биологии Методы молекулярной биологии делятся на две большие группы. Первая группа занимается исследованием структуры и функции белковых молекул. Молекулярная биология использует широкий арсенал биологических, физических и химических методов, как известных ранее, до возникновения дисциплины, так и созданных в процессе ее собственного развития специально для работы с молекулярными объектами. Физические методы изучения структуры и свойств нуклеиновых кислот и белков: рентгеноструктурный анализ, электронная микроскопия, седиментационный анализ, хроматография. Химические методы: «метод хирургии молекул», методы определения первичной структуры биополимеров, метод адресованных реагентов. Модификация биологических макромолекул in vivo и in vitro и изучение их функциональных свойств. Биологические и биохимические методы: культуры клеток, гибридные клетки, бесклеточные системы, клеточные линии гибридов, получение моноклональных антител, гель-фильтрация, изоэлектрофокусирование, гель-электрофорез, другие методы фракционирования биополимеров. Методы генетической инженерии: рекомбинантные ДНК, рестрикция ДНК. Ферменты генетической инженерии. Рестриктазы и их виды, свойства и особенности воздействия на ДНК. Клонирование ДНК. Плазмиды. Векторы молекулярного клонирования. Гибридизация нуклеиновых кислот. ДНК-зонды. Блоттинг, его виды. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК: метод Максама - Гилберта, метод Сангера - Коульсона, их модификации. Химико-ферментативный синтез генов. Получение генов с использованием обратной транскриптазы. Достижения и перспективы генетической инженерии. Получение пептидных гормонов: гормон роста человека, соматотропный гормон, инсулин. Среди методов работы с генами и нуклеиновыми кислотами в наборе молекулярной биологии можно отметить экспрессию генов, полимерно-цепную реакцию, различные виды блоттинга генов, а также методики по определению последовательностей ДНК. Оценивая молекулярную революция в контексте истории биологии, нетрудно заметить, что рождение молекулярной биологии было кульминацией длительного процесса, который начался с первых наблюдений, сделанных под микроскопом. Ранние исследователи пытались понять, как функционируют живые организмы на микроскопическом уровне. С конца XVIII в. все большее внимание уделялось описанию особенностей химических молекул, производящихся живыми организмами. Так в трудах выдающихся химиков, таких как Юстус Либих, родилась физиологическая химия, предшественница современной биохимии, в свою очередь, обязанной своим рождением Эдуарду Бухнеру. Однако между молекулами, которые изучали химики, и тонкими структурами, заметными под микроскопом, например, хромосомами, лежала область неизвестного, «мир упущенных измерений», как его называл выдающийся физико-химик Вольфганг Освальд. 1.1 Первые исследования молекул Оценивая молекулярную революция в контексте истории биологии, нетрудно заметить, что рождение молекулярной биологии было кульминацией длительного процесса, который начался с первых наблюдений, сделанных под микроскопом. Ранние исследователи пытались понять, как функционируют живые организмы на микроскопическом уровне. С конца XVIII в. все большее внимание уделялось описанию особенностей химических молекул, производящихся живыми организмами. Так в трудах выдающихся химиков, таких как Юстус Либих, родилась физиологическая химия, предшественница современной биохимии, в свою очередь, обязанной своим рождением Эдуарду Бухнеру. Однако между молекулами, которые изучали химики, и тонкими структурами, заметными под микроскопом, например, хромосомами, лежала область неизвестного, «мир упущенных измерений», как его называл выдающийся физико-химик Вольфганг Освальд. Этот мир населяли коллоиды, химические соединения, структура и свойства которых оставались неясными. Поворотным пунктом в этом процессе стала работа Лайнуса Полинга 1949 г., в которой впервые болезнь человека, серповидноклеточная анемия, была связана с мутацией в молекуле гемоглобина. При рождении молекулярной биологии произошла встреча двух дисциплин, переживавших в первой половине ХХ века период бурного развития: биохимии и генетики. Биохимики изучали структуру и функции молекул, из которых состоит живая материя. Между 1900 и 1940 гг. были описаны центральные процессы метаболизма: пищеварение и усваивание питательных веществ, в частности, углеводов. Каждый из элементарных химических процессов, из которых состоит метаболизм, катализируется особым ферментом. Ферменты — это белки, так же как антитела крови и белки, отвечающие за сокращения мускулатуры. Поэтому изучение структуры и функции белков стало одной из важнейших задач биохимии. Генетики, благодаря введению Томасом Морганом плодовой мушки дрозофилы в качестве модельного организма, установили справедливость законов Менделя и открыли множество новых фактов и закономерностей в отношениях между генами. В частности, Морган показал, что гены локализованы на хромосомах. Тем не менее, химическая природа генов и молекулярные механизмы их действия оставались загадкой. 1.2 Исследования структуры ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках – долговременное хранение информации о структуре РНК и белков. С химической точки зрения ДНК – длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков – нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счет дезоксирибозы и фосфатной группы. В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована. В ДНК встречаются четыре вида азотистых оснований – аденин, гуанин, тимин и цитозин. Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями по принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин – только с цитозином. Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируютя на матрице ДНК за чсет копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) представляет собой биополимер (полианион), мономером которого является нуклеотид. Каждый нуклеотид состоит из остатка фосфорной кислоты присоединённого по 5'-положению к сахару дезоксирибозе, к которому также через гликозидную связь (C—N) по 1'-положению присоединено одно из четырёх азотистых оснований. Именно наличие характерного сахара и составляет одно из главных различий между ДНК и РНК, зафиксированное в названиях этих нуклеиновых кислот (в состав РНК входит сахар рибоза). Пример нуклеотида — аденозинмонофосфат — где основание, присоединённое к фосфату и рибозе, это аденин, показан на рисунке. Исходя из структуры молекул, основания, входящие в состав нуклеотидов, разделяют на две группы: пурины (аденин [A] и гуанин [G]) образованы соединёнными пяти- и шестичленным гетероциклами; пиримидины (цитозин [C] и тимин [T]) — шестичленным гетероциклом. В виде исключения, например, у бактериофага PBS1, в ДНК встречается пятый тип оснований — урацил ([U]), пиримидиновое основание, отличающееся от тимина отсуствием метильной группы на кольце, обычно заменяющее тимин в РНК. Следует отметить, что тимин и урацил не так строго приурочены к ДНК и РНК соответственно, как это считалось ранее. Так, после синтеза некоторых молекул РНК значительное число урацилов в этих молекулах метилируется с помощью специальных ферментов, превращаясь в тимин. Это происходит в транспортных и рибосомальных РНК. Полимер ДНК обладает довольно сложной структурой. Нуклеотиды соединены между собой ковалентно в длинные полинуклеотидные цепи. Эти цепи в подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, обладающих одноцепочечными ДНК-геномами), в свою очередь, попарно объединяются при помощи водородных связей в структуру, получившую название двойной спирали. Остов каждой из цепей состоит из чередующихся фосфатов и сахаров. Фосфатные группы формируют фосфодиэфирные связи между третьим и пятым атомами углерода соседних молекул дезоксирибозы, в результате взаимодействия между 3'-гидроксильной (3' —ОН) группой одной молекулы дезоксирибозы и 5'-фосфатной группой (5' —РО3) другой. Асимметричные концы цепи ДНК называются 3' (три прим) и 5' (пять прим). Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путём присоединения новых нуклеотидов к свободному 3' концу). Как уже было сказано выше, у подавляющего большинства живых организмов ДНК состоит не из одной, а из двух полинуклеотидных цепей. Эти две длинные цепи закручены одна вокруг другой в виде двойной спирали, стабилизированной водородными связями, образующимися между обращёнными друг к другу азотистыми основаниями входящих в неё цепей. В природе эта спираль, чаще всего, правозакрученная. Направления от 3' конца к 5' концу в двух цепях, из которых состоит молекула ДНК, противоположны (цепи «анти параллельны» друг другу). Первую точную модель ДНК Уотсон и Крик построили в 1953 г. на основании данных, полученных к этому моменту Франклин. Их открытие вызвало необыкновенный энтузиазм как у ученых, так и у широкой публики. Статья Уотсона и Крика была опубликована в Nature 25 апреля. Ее содержание было дублировано публичным докладом заведующего лабораторией, в которой работали Уотсон и Крик, Уильяма Брэгга, 14 мая. 1.3 Исследования структуры РНК Ранние работы по исследованию структуры РНК также относятся к 1950 м годам. Уотсон и Крик предполагали, что наличие у рибозы 2`OH группы препятствует образованию двойной спирали, характерной только для ДНК. Были сомнения даже в способности этой макромолекулы к образованию любой спиральной структуры. Высокая степень гетерогенности очищенных образцов препятствовала получению на РНК отчетливых снимков дифракционной картины и их рентгеноструктурному анализу. В 1955 г. был открыт фермент полинуклеотидфосфорилаза, с помощью которого стал возможен искусственный синтез гомогенных нуклеиновых кислот, и данные рентгеноструктурного анализа значительно улучшились. Оказалось, что РНК не только может образовать спираль, но, как и ДНК, способна к созданию двойной спирали, хотя ее структура и отличалась от двойной спирали ДНК. В конце 1950 — начале 1960х годов было опубликовано множество результатов исследований РНК, в том числе о гибридизации РНК и ДНК с образованием двойных спиралей из цепей обеих макромолекулы и даже тройной спирали РНК, а также о структуре небольших фрагментов РНК и динуклеотидов G-C и A-U, кристаллизованных в виде завитков спирали. Современный обзор этих работ был опубликован в 2009 г. К середине 1960х годов были открыты рибосомы, показана их роль в синтезе белка и необходимость информационной РНК для их сборки. Кромеинформационной РНК и РНК, входящей в структуру рибосом, в синтезе белка участвовали также транспортные РНК, доставляющие аминокислоты к рибосоме. В 1965 г. была определена первичная структура первой транспортной РНК, а к 1968 г. сразу несколько групп ученых получили кристаллы транспортных РНК, хотя еще недостаточно хорошего качества, чтобы стало возможно определить их пространственную структуру. Эта цель стала достижимой благодаря кристаллизации в 1971 г. тРНКPHE из дрожжей. Работа по исследованию пространственной структуры тРНКPHE была закончена к 1973 г. Впоследствии методы этой пионерской работы были применены к кристаллизации и исследованию пространственной структуры и других тРНК. Оказалось, что кроме линейной или спиралевидной формы, по крайней мере, такие РНК, как транспортные, как и белки могут иметь компактную глобулярную структуру. Рибозимы и структура рибосомы В 1980х годах было показано, что некоторые РНК способны к аутокаталитическому расщеплениИ РНК, способные, как и ферменты, катализировать химические реакции, такие как аутокаталитическое расщепление, назвали рибозимами. В 1990х годах у некоторых из рибозимов была изучена пространственная структура. Это были первые глобулярные РНК кроме транспортных, у которых стало возможно изучать пространственную структуру. На этой основе далее были проведены исследования особенностей формирования структуры РНК, выявление консервативных структурных мотивов, локальных стабилизирующих взаимодействий между фрагментами нуклеотидной последовательности и т. д. Эти достижения стали возможными, благодаря появлению метода транскрипции in vitro. Кроме того, для изучения структуры РНК начали применять ядерный магнитный резонанс, который оказался особенно полезен для исследования малых РНК (RNAs) Впоследствии развитие методов изучения структуры РНК позволило исследовать пространственную структуру еще целого ряда макромолекул этого вида, включая рибосомальную РНК. Глава 2. Первые исследования структуры белка Белки (протеины – «1-е», «значимые») – нерегулярные биополимеры, мономерами которых являются L – аминокислоты. Занимают 1-е место среди всех макромолекул живой клетки (50-80 % сухого веса клетки). Это молекулярные инструменты, с поддержкой которых генетическая информация организма получает свое настоящеё олицетворение. Многообразие белков, их свойства и особенности. Функции белков. Структурная организация. Примеры связи структуры и функций белков. α-спирали, β-складчатые листы. Структурная систематизация. Сверхвторичные структуры. Домены. Фолдинг. Молекулярные шапероны, их роль в фолдинге полипептидных цепей. Метаболоны. Белковая инженерия. Проектирование абзимов и перспективы их использования. Прионы, патологические итоги. Первое выделение и систематизация. Как специальный класс биологических молекул, белки были определены еще в XVIII в. Антуаном де Фуркруа. Сначала их называли альбуминами (matières albuminoides, albuminoids либо Eiweisskörper) и их классическими свойствами считали способность к свертыванию либо коагуляции при обработке теплом либо кислотой. Сходство между свертыванием яичного белка и створаживанием молока было известно с древнейших времен. Даже само слово альбумин было предложено еще Плинием Старшим и происходит от латинского выражения albus ovi (белок яичный). Якоб Берцелиус и Геррит Ян Мульдер провели элементный обзор растительных и звериных белков и пытались определить их эмпирическую формулу. К их изумлению, у всех белков формула оказалась приблизительно идентичной: Cсорок0H620N100O120, разными были лишь содержание серы и фосфора, присутствовавшие в касательно маленьких пропорциях. Мульдер полагал, что существует цельная базовая белковая субстанция (Grundstoff), которая синтезируется в растениях и усваивается звериными при переваривании. Берцелиус поддержал эту идею, назвав субстанцию протеином. Мульдер также идентифицировал продукты деградации протеина, в частности, аминокислоту лейцин, и определил её молекулярную массу, девять9">сто тридцать один Da. Чистка и определение массы. Минимальная молекулярная масса протеина, согласно обзору Мульдера, была примерно 9 kDa, в сотни раз больше, чем у большинства других молекул, с которыми ему приходилось сталкиваться. Следственно химическая структура протеина (вернее, первичная структура) оставалась неведомой до одна тысяч девятисот сорока девяти г., когда Фредерик Сенгер определил аминокислотную последовательность первого белка, которым был инсулин. Франц Хофмайстер и Эмиль Фишер предсказали, что белки представляют собой линейную цепь из аминокислотных остатков, соединенныхпептидными связями. Многие ученые сомневались, что столь длинные аминокислотные цепи могут оставаться стабильными в растворе, и существовали также альтернативные теории о допустимом строении белков. К примеру, согласно коллоидной догадке, белки состоят из циклолов. То, что белки все-таки являются макромолекулами с определенной структурой, а не коллоидными смесями, показал Теодор Сведберг с помощью аналитического ультра центрифугирования. С помощью чистки из ткани сложно получить белок в числе больше, чем некоторое количество миллиграммов. Следственно ранние изучения проводили на протеинах, легко очищаемых из яичного белка, крови, а еще различных токсинов и пищеварительных соков, получаемых со скотобоен. Техника чистки белка стремительно прогрессировала во время 2-й мировой войны в связи с необходимостью получать очищенные белки крови для лечения раненых солдат. В конце одна тысяча девятьсот пятьдесят г. американская организация Armour and Company очищала в крупных числах рибонуклеазу А и даром предоставляла ее для изучений. В итоге РНКаза А на некоторое количество десятилетий стала основным объектом фундаментальных изучений для множества научных групп. В частности, на ней было сделано некоторое количество работ, удостоенных Нобелевской премии. Пространственная структура. Изучения пространственной структуры белка начались в 1910х годах, когда Вопль и Мартин показали, что при коагуляции выпадению белка в осадок предшествует иной процесс, денатурация, при которой белок теряет растворимость и ферментативную активность, но приобретает добавочные химические свойства. В середине 1920х годов было подмечено, что изредка денатурация может быть обратимой и видовидоизменение свободной энергии при этом процессе значительно поменьше, чем при обыкновенных химических реакциях, а к одна тысяча девятьсот двадцать девять г. возникли представления о том, что денатурация представляет собой изменение конформации аминокислотной цепи, при которой остатки, раньше находившиеся внутри белковой глобулы, сейчас экспонированы в растворитель. В самом начале одна тысяча девятьсот шестьдесят г. Кристиан Анфинсен показал, что РНКаза А реально денатурирует обратимо, и что обычная конформация этого белка соответствует глобальному минимуму свободной энергии. Когда структура белка еще не была известна, Дороти Ринч и Ирвинг Ленгмюр для обоснования догадки о циклолах предположили, что эти структуры стабилизируются за счет гидрофобных связей. Правда идею о гидрофобных взаимодействиях поддержал сам Джон Бернал, она в 1930х годах была отвергнута совместно с догадкой о циклолах Лайнусом Полингом и другими изыскателями. Полинг был последователем водородных связей, теорию которых развивал Уильям Астбери. Невзирая на то, что роль водородных связей в стабилизации структуры белка в конце концов оказалась незначительной, это не помешало Полингу правильно сформулировать представления об основных структурных элементах белка, альфа-спиралях и бета-складках. Важность гидрофобных связей прояснилась лишь к одна тысяча девятьсот пятьдесят девять г., когда было показано, что ионизация части аминокислотных остатков, показанная еще Арне Тиселиусом, играет роль лишь на поверхности белковой глобулы, где полипептидная цепь входит в контакт с растворителем. Пространственную схему глобулярных белков сначала постигали лишь гидродинамическими способами и ультра центрифугированием. В 1950х годах возникли спектральные способы, включая круговой дихроизм, флуоресценцию, определение спектров поглощения в ультрафиолетовой и инфракрасной областях. Кристаллография и рентгеноструктурный обзор для определения пространственной структуры гемоглобина были первый раз применены Перуцом и Кендрю в 1960х годах. За эту работу они были удостоены Нобелевской премии. В 1980х годах начали также применятьядерный магнитный резонанс. К две тысячи шесть г. Protein Data Bank содержал данные о пространственной структуре 40 тысяч белков. Благодаря обнаружению консервативных доменов, гомологичные структуры разных белков сейчас можно реконструировать с помощью компьютерных программ, а для изучения структуры огромных межбелковых комплексов используют криоэлектронную микроскопию. 2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) В самом начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Har Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с поддержкой пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров. Впрочем в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была опять открыта в одна тысяча девятьсот восемьдесят третьем году Кэри Маллисом (Kary Mullis). Его целью было разработка способа, который бы разрешил амплифицировать ДНК в процесе неоднократных последовательных удвоений начальной молекулы ДНК с поддержкой фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в одна тысяча девятьсот девяносто третьем г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию. В самом начале применения способа после всякого цикла нагревания — охлаждения доводилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она стремительно инактивировалась при высокой температуре, нужной для распределения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В одна тысяча девятьсот восемьдесят шестом г. она была гораздо усовершенствована. Было предложено применять ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать уйма циклов реакции. Их применение разрешило упростить и автоматизировать осуществление ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недочет этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ложного нуклеотида у неё довольно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, владеют таким механизмом, их применение значительно сокращает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Теперь используют смеси Taq и Pfu, дабы добиться единовременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования. В момент изобретения способа Маллис работал в организации Цетус (Cetus), которая и запатентовала способ ПЦР. В одна тысяча девятьсот девяносто втором году Цетус продала права на способ и патент на применение Taq-полимеразы организации Хофман-Ла Рош (Hoffmann-La Roche) за триста млн баксов. Впрочем выяснилось, что Taq-полимераза была охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в одна тысяча девятьсот восемьдесятом году, в связи с чем фирма Промега (Promega) пыталась в судебном порядке принудить Рош отказаться от исключительных прав на данный фермент. Американский патент на способ ПЦР истёк в марте две тысячи пять г Полимеразная цепная реакция – экспериментальный способ молекулярной биологии, разрешающий добиться существенного увеличения мелких концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале. Такой процесс увеличения числа копий ДНК именуется амплификацией. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется особым ферментом – полимеразой. ДНК-полимераза – фермент, участвующий в репликации (амплификации ДНК в живых организмах) ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов по цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве образца. Тип нового нуклеотида определяется по тезису комплементарности с образцом, с которого ведется считывание. ДНК-полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3'-концу собираемой цепочки. Это приводит к элонгации (удлинению) цепочки в направлении 5'-3'. Ни одна из знаменитых ДНК-полимераз не способна сделать цепочку «с нуля»: они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже присутствующей 3'-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере – короткой последовательности нуклеотидов (почаще 20-25), комплементарной концевым участкам постигаемого гена – к которому она могла бы добавить 1-й нуклеотид. Праймеры состоят постоянно из оснований ДНК и РНК, при этом 1-е два основания постоянно РНК-основания. Праймеры синтезируются иным ферментом – праймазой. Еще один фермент – геликаза – нужен для раскручивания двойственный спирали ДНК с образованием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК. Кое какие ДНК-полимеразы владеют также способностью исправлять ошибки во опять собираемой цепочке ДНК. Если происходит выявление неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад, исключает из неверный нуклеотид из цепочки, после этого вставляет на его место положительный, после этого репликация продолжается в обыкновенном режиме. 2.2 Разновидности ПЦР «Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Применяют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует узачастуюк ДНК внутри продукта первой реакции. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — применяется в том случае, если известный лишь маленький участок внутри необходимой последовательности. Данный способ в особенности пригоден, когда необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с дальнейшим соединением фрагментов (лигирование). В итоге знаменитые фрагменты оказываются на обоих концах незнакомого участка, после этого можно проводить ПЦР как всегда. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) — применяется для амплификации, выделения либо идентификации знаменитой последовательности из библиотеки РНК. Перед обыкновенной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с поддержкой ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая Применяется в качестве матрицы для ПЦР. Этим способом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены. Ассиметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда необходимо амплифицировать предпочтительно одну из цепей начальной ДНК. применяется в некоторых Способологиях секвенирования и гибридизационного обзора. ПЦР проводится как всегда, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) — применяется для стремительного измерения числа определенной ДНК, кДНК либо РНК в пробе. Количественная ПЦР в настоящем времени (Quantitative real-time PCR) — в данном способе применяют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения числа продукта реакции по мере его накопления. Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) — с поддержкой этого способа сокращают воздействие неспецифического связывания праймеров на образование продукта. 1-е циклы проводят при температуре выше температуры отжига, после этого всякие некоторое количество циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК. Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Polony - PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. ПЦР с стремительной амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR) ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (десять тысяч оснований и больше). Применяют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза нужна для того, дабы корректировать ошибки, внесенные первой. RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда необходимо различить близкие по генетической последовательности организмы, к примеру, различные сорта культурных растений, породы собак либо близкородственные микробы. В данном способе обыкновенно применяют один праймер небольшого размера (двадцать — двадцать пять п.н.). Данный праймер будет отчасти комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая обстоятельства (длину праймера, его состав, температуру и пр.), получается добиться удовлетворительного различия картины ПЦР для 2-х организмов. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна отчасти либо неведома совсем, можно применять вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться всякие основания. К примеру, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н — А, Т либо С 2.3 Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) Использование способа ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет грандиозное значение для решения многих проблемных задач микробиологии и эпидемиологии. ПЦР-Способ разрешил разтрудиться новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания. В частности, его применяют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), что не получается осуществить другими способами. При этом не требуется работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный отрезок вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического распределения ДНК и окраски их бромистым этидием. Особенно осмысленно и результативно использование ПЦР для обнаружения микробов сложно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микробы, способные долго персистировать в организме владельца. Высокоспецифичная, эмоциональная и стремительная диагностика многих тяжелых заболеваний содействует не только их результативному лечению, но и предотвращению распространения вирусы. Особенно результативно и экономически оправданно использование способа в урогинекологической практике - для обнаружения хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной вирусы; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для обнаружения геликобактериоза ; в больнице инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В,С и G; В гематологии - для выявления цитомегаловирусной вирусы, онковирусов. В криминалистике ПЦР применяют для сопоставления так называемых «генетических отпечатков пальцев». Нужен пример генетического материала с места правонарушения — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сопоставляют с генетическим материалом подозреваемого. Довольно вовсе малого числа ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, после этого амплифицируют с поддержкой ПЦР. Фрагменты разделяют с поддержкой гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint). На лизатах индивидуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность единовременно исследовать два локуса, расположенных на различных негомологичных хромосомах. Такой подход обеспечивает неповторимую возможность тонкого генетического обзора и постижения хромосомной рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др. Метод обзора индивидуальных сперматозоидов сразу обнаружил фактическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование гаплоидных клеток разрешает определять отцовство. ПЦР обнаружила применение и в персонализированной медицине. Известно, что множество лекарственных препаратовенных препаратов действуют не на всех пациентов, для которых они предуготовлены, а лишь на 30-70 % их числа. Помимо того, многие лекарства оказываются токсичными либо аллергенными для части пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных отличиях в чувствительности и метаболизме лекарств и их производных. Эти отличия детерминируются на генетическом уровне. К примеру, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть больше активен, у иного — менее. Для того, дабы определить, какой разновидностью цитохрома владеет данный пациент, предложено проводить ПЦР-обзор перед использованием лекарства. Такой анализ называют заблаговременным генотипированием (англ. prospective genotyping). Заключение Молекулярная биология, возникшая во 2-й половине ноль099">двадцать столетия, постигает особенности структуры и функций нерегулярных биополимеров - нуклеиновых кислот и белков, обеспечивающих существование биологической формы движения материи, механизмы хранения, передачи и реализации генетической информации. Распознавание ДНК как носителя генетической информации. Работы по рентгеноструктурному обзору ДНК, выяснению химического состава нуклеиновых кислот. Подтверждение универсальности ДНК в зверином и растительном мире. Реализация биспиральной модели молекулы ДНК. Расшифровка структуры ряда белков. Обнаружение связи между структурой и функцией белков. Становление основного постулата молекулярной генетики: ДНК → РНК → белок. Обнаружение основных этапов биосинтеза белков и тезисов его регуляции. Расшифровка генетического кода. Химический синтез гена. Освоение структурной организации рибосомы. Выяснение основных механизмов синтеза нуклеиновых кислот. Открытие обратной транскрипции. Освоение первичной структуры ДНК. Приобретение рекомбинантных ДНК. Открытие сплайсинга, рибозимов и аутосплайсинга. Мобильные генетические элементы. освоение молекулярной организации мембран. 0 белковой инженерии и инженерной энзимологии. Современные аспекты: план «Геном человека», расшифровка структур геномов, реализация банка генов, геномная дактилоскопия, полимеразная цепная реакция, изучение молекулярных основ эволюции, адаптации, био многообразия, канцерогенеза и др.). ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получить сто млрд. сходных по структуре молекул и однозначно «увидеть» нужные участки, а после этого проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического примера, на присутствие в его составе участка чужеродной либо измененной генетической информации. «Эта реакция примитивна в исполнении: необходимы лишь пробирка, некоторое количество примитивных реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который нужно копировать может быть чистым, а может представлять собой трудную смесь разных биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и человеческий волос, и биоптат ткани, и капля засохшей крови, найденная на месте правонарушения, и мозг мумии, и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в постоянной мерзлоте. За годы, прошедшие со времени открытия полимеразной цепной реакции, она обнаружила использование во всех отраслях биологии: опубликовано больше одна тысяча работ, в которых была использована эта реакция. Идея её так примитивна, что, рассматривая значение ПЦР для улучшения биологических изучений, многим сейчас кажется невообразимым, что абсолютно никто не додумался до нее прежде, правда уже много назад все необходимые для выполнения этой реакции компоненты были доступны». Список использованной литературы Глик Б., Пастренак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение – Москва: Мир, 2002. Сингер М., Берг П. Гены и геномы – Москва: Мир, 1998. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004 В мире Науки (Scientific American). Июнь № 6 1990 г Трофимова Т. И. Курс физики. Москва: Высшая школа, 2002 Стильбанс Л. С. Физика полупроводников. Москва, 1967. |