Честнова т. В., Смольянинова о. Л. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология
 Скачать 1.58 Mb.
|
|
Тема 5. Микрофлора организма человека. 5.1. Нормофлора, ее значение для микроорганизма. Понятие о транзиторной флоре. Понятие о дисбиотических состояниях. Их оценка. Методы коррекции. Организм человека заселен (колонизирован) примерно 500 видами микроорганизмов, соствляющих его нормальную микрофлору в виде сообщества микроорганизмов (микробиоценоз). Они находятся в состоянии равновесия друг с другом и с организмом человека, являются комменсалами, не причиняющими вреда человеку. Микрофлора колонизирует поверхность тела и полости, сообщающиеся с окружающей средой. В норме микроорганизмы отсутствуют в легких, матке и во всех внутренних органов. В организме человека выделяют постоянную и транзиторную микрофлору. Постоянная (резидентная, индигенная, или автохтонная) микрофлора представлена микроорганизмами постоянно присутствующими в организме. Транзиторная (непостоянная или аллохтонная) – микрофлора не способна к длительному существованию в организме. Постоянную микрофлору можно разделить на облигатную и факультативную. Облигатная микрофлора (бифидобактерии, лактобактерии, пептострептококки, кишечные палочки) является основой микробиоценоза, а факультативная микрофлора (стафилококки, стрептококки, клебсиеллы, клостридии, некоторые грибы) включает меньшую часть микробиоценоза. Количество микроорганизмов у взрослого человека составляет около 1014 особей, причем преобладают в значительной степени облигатные анаэробы. Нормальная микрофлора выстилает слизистые оболочки в виде биопленки. Это полисахаридный каркас состоит из полисахаридов микробных клеток и муцина. В нем находятся микроколонии клеток нормальной микрофлоры. Толщина биопленки 0,1-0,5 мм. В ней содержится от нескольких сотен до несколько тысяч микроколоний. Микрофлора кожи. Кожу колонизируют грамположительные бактерии (эпидермальные стафилококки, коринеформные бактерии, микрококки, пептострептококки, стрептококки, дрожжеподобные грибы. Микрофлора конъюнктивы (коринеформные бактерии, стафилококки). Микрофлора верхних дыхательных путей (бактероиды, коринеформные бактерии, гемофильные палочки, лактобактерии, стафилококки, стрептококки, нейссерии). Трахеи, бронхи, альвеолы обычно стерильны. Микрофлора ЖКТ: в полости рта обитают бактероиды, превотеллы, порфиромонады, бифидобактерии, лактобактерии, нейссерии, стрептококки, стафилококки, грибы рода Кандида и простейшие и др, в 1мл слюны обитает 108бактерий; пищевод практически не содержит микроорганизмов; микрофлора желудка представлена лактобациллами и дрожжами, единичными кокками и грамотрицательными бактериями. При гастритах и язвенной болезни желудка обнаруживается хеликобактер пилори. Концентрация бактерий в 1 мл 103. В тонкой кишке находится 105-108 микроорганизмов на 1мл. Здесь обнаруживаются бифидобактерии, лактобактерии, клостридии, энтерококки, порфиромонады, превотеллы, анаэробные кокки. В толстой кишке содержится до 1012 микроорганизмов в 1г фекалий. Основными представителями микрофлоры толстой кишки являются: бифидобактерии, лактобактерии, клостридии, энтерококки, бактероиды, кишечные палочки, цитробактер, энтеробактер Значение микрофлоры организма человека:
Представители нормальной микрофлоры при снижении сопротивляемости организма вызывают гнойно-воспалительные процессы, т.е. нормальная микрофлора может стать источником аутоинфекции. Например, бактероиды, обитающие в норме в кишечнике, могут вызывать абсцессы, проникая в различные ткани в результате травмы или хирургической операции. Эпидермальный стафилококк в норме часто встречающийся на коже склонен колонизировать внутривенные катетеры, вызывая нарушения кровотока. Такие комменсалы кишки, как кишечная палочка, поражают мочевую систему (цистит). зличные ткани в резерме в кишечнике, могут вызывать абсцессы Состояние эубиоза- динамического равновесия нормальной микрофлоры может нарушаться под влиянием факторов окружающей среды, стрессовых воздействий, бесконтрольное применение антибиотиков, лучевой и химиотерапии, нерационального питания в результате чего нарушается колонизационная резистентность. Состояние, развивающееся в результате утраты нормальных функций микрофлоры, называются дисбактериозом и дисбиозом. При дисбактериозе происходят стойкие количественные и качественные изменения бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры. Дисбиозы классифицируют по этиологии (грибковый, стафилококковый, протейный), по локализации (дисбиоз рта, кишечника, влагалища). Нарушения нормальной микрофлоры человека определяются следующим образом:
Для восстановления нормальной микрофлоры: 1) проводят селективную деконтаминацию (избирательное удаление из пищеварительного тракта аэробных бактерий и грибов, например комплексное назначение ванкомицина, гентамицина и нистатина); 2) назначают препараты пробиотиков, полученных из лиофильно высушенных живых бактерий (бифидумбактерий, лактобактерий, кишечной палочки. Тема 6. Генетика микробов. 6.1. Строение бактериального генома. Фенотипическая и генотипическая изменчивость микроорганизмов. Мутации. Модификации. Наследственный аппарат бактерий представлен одной хромосомой, которая представляет собой молекулу ДНК, она спирализована и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране. Бактериальная хромосома кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции. Плазмиды – дополнительный внехромосомный генетический материал. Представляет собой кольцевую, двунитевую молекулу ДНК, гены которой кодируют дополнительные свойства, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования. В зависимости от свойств признаков, которые кодируют плазмиды, различают:
Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды. Некоторые плазмиды могут обратимо встраиваиться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными или эписомами. В состав бактериального генома, как в бактериальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны. IS-последовательности – это короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки). Транспозоны – это более крупные молекулы ДНК. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген. Транспозоны способны перемещаться по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии генов. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы (автономно), но неспособны к автономной репликации. Различают два вида изменчивости – фенотипическую и генотипическую. Фенотипическая изменчивость (ненаследственная) – модификации – не затрагивают генотип. Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т.е. возвращаются к исходному фенотипу. Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В основе ее лежат мутации и рекомбинации. Мутации – изменение генотипа, сохраняющееся в ряду поколений и сопровождающееся изменением фенотипа (морфологические, культуральные, биохимические, биологические). По лркализации различают мутации:
По происхождению мутации могут быть:
6.2.Генотипические рекомбинации микроорганизмов. Основы генной инженерии. Практическое применение. Рекомбинации – обмен генетическим материалом между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом. У бактерий существует несколько механизмов рекомбинаций:
Трансформация – передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНК-донора. Для трансформации необходимо особое физиологическое состояние клетки-реципиента – компетентность. Фактор компетентности – белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку. Трансдукция – это передача генетической информации между бактериальными клетками с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить один ген или более. Трансдукция бывает: специфической (переносится всегда один и тот же ген, трансдуцирующий фаг всегда располагается в одном и том же месте); 2) неспецифический (передаются разные гены, локализация трансдуцирующего фага непостоянна). Конъюгация – обмен генетической информацией при непосредственном контакте донора и реципиента. Наиболее высокая частота передачи у плазмид, при этом плазмиды могут иметь разных хозяев. После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК- донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше этот контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту. Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии. Генетическая инженерия является сердцевиной биотехнологии. Она, по существу, сводится к генетической рекомбинации, т.е. к обмену генами между двумя хромосомами. Метод рекомбинации in vitro или генетической инженерии заключается: а) в выделении или синтезе ДНК из отличающихся друг от друга организмов или клеток; б) получении гибридных молекул ДНК; в) введении рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки; г) создании условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами. Экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство – продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Методом генетической инженерии созданы сотни препаратов медицинского и ветеринарного назначения, получены рекомбинантные штаммы-суперпродуценты, многие из которых нашли практическое применение. Уже применяются в медицине полученные методом генетической инженерии вакцины против гепатита В, интерлейкины, инсулин, гормоны роста, интерфероны, фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды, эритропоэтин, антигены ВИЧ. Разработаны и в ближайшие годы будут использованы в практике генно-инженерные вакцины против малярии, ВИЧ-инфекции, сифилиса, клещевого энцефалита, холеры, бруцеллеза, гриппа, бешенства идр. Тесты по теме: 1.. Бактериальный геном состоит: а) пили б) бактериальная хромосома в) плазмиды г) капсула 2. Репликон, кодирующий жизненно важные для бактерии функции: а) пили б) бактериальная хромосома в) плазмиды г) капсула 3. Репликон, кодирующий не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции: а) пили б) бактериальная хромосома в) плазмиды г) капсула 4. Плазмиды, способные передаваться из одной бактериальной клетки в другую называют: а) интегративными (эписомы) б) трансмиссивными в) мобилизуемыми 5. Плазмиды, обратимо встраивающиеся в бактериальную хромосому и функционирующие в виде единого репликона: а) интегративными (эписомы) б) трансмиссивными в) мобилизуемыми 6. Плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам: а) Ent-плазмида б) Hly-плазмида в) Col-плазмида г) R-плазмида 7. К подвижным генетическим элементам относятся: а) эписомы б) транспозоны в) IS-элементы г) R-плазмиды 8. Изменения в последовательности отдельных нуклеотидов ДНК, приводящие к изменению морфологии бактерий, устойчивости к антибиотикам и др.: а) генетическая рекомбинация б) трансдукция в) мутация г) конъюгация 9. Мутации, возникающие под влиянием внешних факторов (мутагенов): а) спонтанные б) конъюгация в) индуцированные г) реверсия 10. Восстановление исходных свойств у мутантов: а) спонтанные б) конъюгация в) индуцированные г) реверсия 11. К биологическим мутагенам относятся: а) УФ-лучи б) гамма-радиация в) транспозоны г) азотистая кислота 12. Взаимодействие между двумя генами: а) мутация б) реверсия в) генетическая рекомбинация 13. Передача бактериальной ДНК посредством бактериофага: а) конъюгация б) трансдукция в) трансформация г) реверсия 14. Передача генетического материала путем непосредственного контакта бактериальных клеток: а) конъюгация б) трансдукция в) трансформация г) реверсия 15. Передача генетического материала от клетки донора реципиенту при помощи изолированной ДНК и фактора компетентности: а) конъюгация б) трансдукция в) трансформация г) реверсия Тема 7. Противомикробные препараты 7.1. Антибиотики. Природные и синтетические. Классификация антибиотиков по химической структуре, механизму, спектру и типу действия. Способы получения. Химиотерапевтические препараты – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным действием. По направленности действия химиотерапевтические препараты делят на:
По химическому строению выделяют несколько групп химиотерапевтических препаратов:
Антибиотики – это химиотерапевтические препараты из химических соединений биологического происхождения (природные), а также их полусинтетические производные и синтетические аналоги, которые в низких концентрациях оказывают избирательное повреждающее или губительное действие на микроорганизмы и опухоли. Требования, предъявляемые к антибактериальным препаратам:
Классификация антибиотиков. В основу классификации антибиотиков положены разные принципы: 1. По способу получения (природные, синтетические и полусинтетические). 2.По направленности действия (антибактериальные, противогрибковые, противоопухолевые). 3. По числу видов (широкоспекторные, узкого спектра действия). 4.По происхождению продуцентами большинства антибиотиков являются грибы (плесневые- пенициллин, стрептомицин, тетрациклин), бактерии (полимиксин, грамицидин), высшие растения (фитонциды чеснока и лука), ткани животных и рыб (лизоцим, интерферон). 5. По химическому строению: Бета-лактамы, гликопептиды, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, линкозамиды, левомицетин, рифамицины, полипептиды, полиены, разные антибиотики. 6. По механизму антимикробного действия антибиотики делят на несколько групп:
7.2. Лекарственная устойчивость бактерий, пути ее преодоления. Методы определения чувствительности к антибиотикам. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют диско-диффузным (метод диффузии в агар с применением бумажных дисков с антибиотиками) и метод разведений антибиотикак в плотной или жидкой питательной среде. Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории. Диско-диффузный метод следует рассматривать как качественный. Методы разведения – более точные количественные способы исследования. Их применяют в особо важных практических случаях и научно-исследовательской работе. Диско-диффузный метод. Для исследования можно использовать стандартные питательные среды: отечественные среды АГВ №1, №2 и зарубежные – Мюллер-Хинтон агар. На поверхность подсушенной питательной среды в чашке Петри наносят 1мл исследуемой культуры (18-20 часовой бульонной культуры или стомиллионной суспензии из агаровой культуры., равномерно распределяют путем покачивания чашки и удаляют если необходимо избыток пипеткой. После посева чашки подсушивают при комнатной температуре 10-15 мин. Диски с антибиотиками накладывают пинцетом на равном расстоянии друг от друга и на 2 см от края чашки (на одну чашку не более 6 дисков). Чашки сразу ставят в термостат вверх дном и инкубируют при 370С в течение 18-20 ч (время инкубации зависит от вида исследуемого микроорганизма. Для учета результатов чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность и освещают настольной лампой под углом 450. Допускается учет в проходящем свете. С помощью линейки измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр дисков, с точностью до 1мм. Оценку результатов проводят по таблице. В медицинской практике обычно определяют 3 группы микроорганизмов по чувствительности к антибиотикам: чувствительные, среднечувствительные и устойчивые. «Чувствительные» микроорганизмы, когда обычно применяемые дозы антибиотика могут обеспечить лечебный эффект. «Среднечувствительные» микроорганизмы – повышенные дозы антибиотика могут обеспечить лечебный эффеки. «Устойчивые» микроорганизмы – нельзя рассчитывать на лечебный эффект. Метод серийных разведений. Для исследования используют мясопептонный бульон. Основные растворы антибиотиков приготавливают путем взвешивания их порошка и растворения его в стерильной дистиллированной воде, чтобы получить определенную удобную концентрацию. Разведения антибиотиков готовят путем разбавления основного раствора антибиотика бульоном. Для этого используют 11 пробирок. В первую пробирку вносят 2 мл раствора антибиотика и переносят по 1 мл раствора антибиотика из первой пробирки в каждую последующую. Затем суточную бульонную культуру разводят до 105 – 106 микробных тел в 1 мл и вносят по 1 мл во все пробирки с разведениями антибиотика. Посевы инкубируют при 370С. Отмечают первую пробирку с задержкой роста микробов. Ускоренные методы определения чувствительности. Ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам осуществляется некоторыми зарубежными автоматизированными системами микробиологических исследований. В кюветах панели содержатся дегидрированные субстраты или диски с антибиотиками. Каждый антибиотик в кювете представлен в одной концентрации, соответствующей критерию принадлежности бактерий к группе «чувствительных» к антибиотику. Одновременно тестируется 20 и более антибиотиков. После внесения взвеси испытуемых бактерий посевы инкубируют при 35-370С в течение 4-5 часов. Результаты регистрируют спектрофотометрически или кондуктометрически сразу при появлении размножения бактерий в контроле без антиб |