Честнова т. В., Смольянинова о. Л. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология
 Скачать 1.58 Mb.
|
|
2. Специального назначения: а) элективные среды – это среды, на которых растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9, служит для выделения холерного вибриона. б) среды обогащения – это такие среды, которые стимулируют рост какого-то определенного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, магниевая и селенитовая среды стимулируют рост бактерий рода сальмонелла, ингибируя рост кишечной палочки. в) дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий (среды Гисса). г) комбинированные питательные среды сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры и дифференциально-диагностическую (среда Плоскирева для выделения шигелл, висмут-сульфитный агар – для сальмонелл). Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки. С целью дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий используют селективные среды. Прототрофы растут на минимальной среде, содержащей только соли и углеводы, так как они сами способны синтезировать нужные им для развития метаболиты. Ауксотрофы нуждаются в средах, содержащих определенные аминокислоты, витамины, т.е. факторы роста. Приготовление питательных сред – один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической работы. В настоящее время медицинской промышленностью организовано производство консервированных сред. Сухие питательные среды находятся в пластмассовых банках с плотно завинчивающимися крышками, обеспечивающими герметичность. Условия культивирования бактерий: 1. Наличие полноценной питательной среды. 2. Определенная температура культивирования (оптимальная температура 370С). 3. Определенная атмосфера культивирования. Для строгих аэробов необходим кислород, поэтому они хорошо растут на поверхности агара чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для роста аэробов в глубинном слое жидкой среды необходимо непрерывно перемешивать или встряхивать питательные среды, чтобы кислород распределялся по всему объему среды. Для факультативных анаэробов используют те же методы. Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода. Концентрация СО2 должна быть 1-5%. Для этого используют специальные СО2 –инкубаторы или посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горячую свечу. Для роста облигатных анаэробов необходимо исключить доступ кислорода. Для этого добавляют к питательным средам редуцирующих кислород веществ (тиогликолевая кислота), регенерация от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения, использование поглотителей кислорода, помещая их в герметически закрываемые емкости «газпаки», использование анаэростатов. 4. Время культивирования (18-48 часов). Для культивирования микобактерий туберкулеза (3-4 недели). 5. Освещение. Для выращивания фототрофных бактерий необходим свет. 6. Культивирование облигатных внутриклеточных паразитов-бактерий, относящихся к родам риккетсия, эрлихия, коксиелла, хламидия осуществляют на культурах клеток или в организме животных и членистоногих, а также в куриных эмбрионах. В промышленных условиях для получения биомассы бактерий или грибов с целью получения антибиотиков, вакцин, диагностических препаратов культивирование осуществляется в аппаратах (ферментерах) при строгом соблюдении оптимальных параметров роста и размножения культур. 3.3. Питание бактерий. Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Среди необходимых питательных веществ выделяют: углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций. Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор. Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ. В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на: 1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО2); 2) гетеротрофы (используют органический С-гексозы, многоатомные спирты, аминолкислоты); Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки. По источникам энергии микроорганизмы делят на: 1) фототрофы – источник солнечная энергия; 2) хемотрофы – получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций; 3) хемолитотрофы – используют неорганические соединения; 4) хемоорганотрофы – используют органические вещества. Медицинская микробиология изучает бактерии, которые являются гетерохемоорганотрофы. По степени гетеротрофности микроорганизмы делятся на: 1) сапрофиты – питаются мертвым органическим материалом; 2) паразиты – питаются за счет макроорганизма. Облигатные паразиты полностью лишены возможности жить вне клеток (риккетсии, хламидии, вирусы). Факультативные паразиты могут жить и без хозяина, т.е. вне организма – на простых питательных средах. Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост. Среди бактерий выделяют: 1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества); 2) ауксотрофы (нуждаются в факторах роста). Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений. Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку: I. Пассивный транспорт (без энергетических затрат): простая диффузия; 2) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков). II. Активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны). Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией. 3.4. Метаболизм бактериальной клетки. В процессе метаболизма выделяют два вида обмена: 1) пластический (конструктивный): анаболизм (с затратами энергии), катаболизм (с выделением энергии); 2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах): дыхание; брожение. В зависимости от акцепторов протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Для аэробов акцептором является кислород. Факультативные анаэробы в кислородных условиях используют процесс дыхания, в бескислородных – брожение. Для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизмов из-за образования перекисей, идет отравление клетки. Облигатные аэробы (бруцеллы, легионеллы, псевдомонады, микобактерии, возбудитель сибирской язвы) растут и размножаются только в присутствии кислорода. Используют кислород для получения энергии путем кислородного дыхания. Они подразделяются на: 1) строгие аэробы (менингококки, бордетеллы), которые растут при парциальном давлении атмосферы воздуха; 2) микроаэрофилы (листерии) растут при пониженном парциальном давлении атмосферного возхдуха. Облигатные анаэробы (бифидобактерии, лактобактерии, клостридии) не используют кислород для получения энергии. Тип метаболизма у них бродильный. Они подразделяются на: 1) строгие анаэробы – микроорганизмы для которых молекулярный кислород токсичен; он либо убивает микроорганизмы, либо ограничивает их рост. Энергию строгие анаэробы получают маслянокислым брожением; 2) аэротолерантные микроорганизмы (молочнокислые бактерии) используют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере. Энергию получают гетероферментативным молочнокислым брожением. Факультативные анаэробы (пневмококки, энтерококки, энтеробактерии, коринебактерии, франциселлы) способны расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и в отсутствии его. Они обладают смешанным типом метаболизма. Процесс получения энергии у них может происходить кислородным дыханием в присутствии кислорода, а в его отсутствии переключаться на брожение. Различное физиологическое отношение микроорганизмов к кислороду связано с наличием у них ферментных систем, позволяющих существовать в атмосфере кислорода. В окислительных процессах, протекающих в атмосфере кислорода образуются токсические продукты: перекись водорода Н2О2 и закисный радикал кислорода О2-. Для нейтрализации токсичных форм кислорода, микроорганизмы, способные существовать в его атмосфере, имеют защитные механизмы. У облигатных аэробов и факультативных анаэробов накоплению закисного радикала кислорода препятствует фермент супероксиддисмутаза. У аэротолерантных микроорганизмов накоплению закисного радикала кислорода препятствует высокая концентрация ионов марганца, перекись водорода разрушается ферментом пероксидазой. У строгих анаэробов наличие фермента супероксиддисмутазы коррелирует с их устойчивостью к кислороду. Для культивирования строгих анаэробов создаются условия, позволяющие удалять атмосферный кислород: использование анаэростатов, добавление в питательные среды редуцирующих кислород веществ, например тиогликолята натрия, использование поглоттелей кислорода. В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами. Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства. По месту действия выделяют: 1) экзоферменты (действуют вне клетки, принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий); 2) эндоферменты (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ). В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов: 1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами); 2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп); 3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей); 4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции); 5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров); 6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ). 3.5.Виды пластического обмена. Основными видами пластического обмена являются: 1) белковый; 2) углеводный; 3) липидный; 4) нуклеиновый. Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты. Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением. В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот. Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования. В белковом обмене процессы синтеза преобладают над распадом, при этом происходит потребление энергии. В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются дл моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов-брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения. В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения: 1) спиртовое (характерно для грибов); 2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий); 3) молочнокислое (характерно для стрептококков); 4) маслянокислое (характерно для сарцин); 5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл). Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный). Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями. Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз. Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т.е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА. Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов. Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требут кислорода. Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот имеет значение для процесса деления клетки. Синтез осуществляется с помощью ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимой-РНК-полимеразы. Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК по материнской. ДНК-зависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК. 3.6. Принципы и методы выделения чистых культур. Ферменты бактерий, их идентификация. Внутривидовая идентификация (эпидемиологическое маркирование). Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевается потомство бактерий, возникающее в результате размножения одной микробной клетки. Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма. Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды. Очень широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха. Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов. Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом. Для изучения свойств колоний микробы культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженной диафрагмой. Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величинаколонии определяется ее диаметром, В зависимости от диаметра различают колонии точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более). Форма колонии бывает правильная — круглая, неправильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев. Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные (фестончатый, волнистый, бахромчатый). Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают (каплеобразные, куполообразные, конусообразные, колонии с вдавленным центром, плоские). Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссоциации. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается под действием антибиотико- и химиотерапии, факторов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также при попадании микроба во внешнюю среду. Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др. Структура колоний определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа. По характеру структуры различают следующие виды колоний:
Консистенцию колонии исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:
На жидких питательных средах характер роста микробов менее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и здесь выявлены следующие формы роста бактерий.
Рост на полужидкой питательной среде. Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2—0,5% полужидкого агара. Подвижные микробы в столбике полужидкого агара вызывают выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толщине среды. Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола среды. Ферменты бактерий принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Также они подразделяются на экзоферменты - ферменты, которые выделяются в окружающую среду и эндоферменты – ферменты, которые образуются бактериальной клеткой и локализуются внутри нее. Сахаролитические ферменты микробов расщепляют углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества: СО2 и Н2. Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам. Так, например, одни бактерии, ферментируя лактозу, остаются нейтральными в отношении глюкозы, другие, наоборот, сбраживают глюкозу, а третьи, наиболее активные, вызывают расщепление и глюкозы, и лактозы. Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также «пестрым» рядом. Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под действием ферментов микроба одни углеводы остаются неизменными и, следовательно, цвет питательной среды не меняетя, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет питательной среды. Среды Гиса бывают жидкими и полужидкими. В пробирки с жидкими средами Гиса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» - труппочку диаметром 0,5-0,7 см, запаянную с одного конца. «Поплавок» помещают запаянным концом кверху. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гиса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности.Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, содержащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуемой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике. Таким образом, при изучении сахаролитических ферментов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в питательной среде конечных газообразных продуктов. Протеолитические ферменты микробов.Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса. Протеолитически активные культуры микробов, например под действием фермента желатиназы разжижают желатин. Некоторые виды патогенных микробов обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, мочевины, аммиака. Определение индола в культуре микроорганизмов. Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической кислоты — триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в нейтральный бульон. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24—48 ч при температуре 37 °С. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете. Определение сероводорода. Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Образование сероводорода хорошо заметно на трехсахарной питательной среде Клиглера или Олькеницкого в виде черного цвета. Окислительно-восстановительные ферменты. В культуре микробов могут быть обнаружены окислительно-восстановительные ферменты, связанные главным образом с дыхательной функцией микроорганизма (оксидаз и дегидраз). Определение фермента каталазы. Некоторые виды микроорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в процессе дыхания образуют перекись водорода, являющуюся клеточным ядом. Количество перекиси водорода в культуре никогда не достигает высоких концентраций, так как по мере образования перекись расщепляется на воду и молекулярный кислород при участии фермента каталазы. На поверхность микробной культуры, выращенной на плотной питательной среде в чашке Петри, наносят 1—2 мл 1% раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое, нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кислорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы. Подобный результат отмечается как положительный результат реакции на каталазу. 3.7. Особенности физиологии грибов, простейших, вирусов и их культивирование. Грибы по типу питания – гетеротрофы, по отношению к кислороду – аэробы и факультативные анаэробы. Культивирование грибов производится в аэробных условиях при температуре 22-370С на питательных среда, содержащих азотистые и углеродсодержащие вещества… По характеру роста на агаровых питательных средах патогенные грибы растут в виде: 1) кожистых, гладких, с плотной консистенцией; 2) пушистых, рыхлых, ватообразной консистенции; 3) бархатисто-ворсистых колоний, покрытых очень густым мицелием; 4) хрупких пленчатых, напоминающих ломкий картон; 5) гипсовидно-мучнистых колоний порошковидной консистенции; 6) мелкозернистых или бугристых кожистой консистенции; 7) крупнобугристых строчковидных колоний; 8) блестящих сальных или матовых колоний сливкообразной консистенции. На жидких средах многие виды грибов растут в виде войлокообразного осадка на дне и пристеночно. Грибы вырабатывают различного цвета пигменты: белые, желтые, коричневые, черные, синие, зеленые, красные и др. Некоторые виды патогенных грибов обладают способностью продуцировать экзотоксины: афлатоксины, липотоксол. Большая часть грибов содержит эндотоксины. Простейшие имеют органы движения (жгутики, реснички, псевдоподии) и выделения (сократительные вакуоли). По типу питания они могут быть гетеротрофами или аутотрофами. Многие простейшие могут расти на питательных средах, содержащих нативные белки и аминокислоты. Также для культивирования простейших используются культуры клеток (тканей), куриные эмбрионы и лабораторные животные. Лейшмании выращивают на агаре с дифибринированной кровью кролика на котором они размножаются при температуре 18- 220С и располагаются в виде розетки. Для культивирования трихомонад используют мясо-пептонный бульон с 0,1% глюкозы, 10% сыворотки лошади или человека, 30 ЕД пенициллина и 200 ЕД стрептомицина на 1мл среды, рН = 6,0, инкубируют при температуре 360С в течение 3-6 дней, затем осадок исследуют на наличие трихомонад. Лямблии выращивают в средах, содержащих экстракты дрожжеподобных грибов. Малярийные паразиты развиваются в питательных средах, содержащих кровь с глюкозой, а также на искусственной питательной среде, содержащей метионин и изолейцин. Токсоплазмы выращиваются в развивающихся эмбрионах кур. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и лабораторных животных. Наиболее широкое применение нашли однослойные культуры трипсинизированных клеток, а также перевиваемые клеточные линии, которые получают из различных органов и тканей животных и человека. Для поддержания их жизнедеятельности использхуют питательные среды (среда 199, Игла и др.), содержащие полный набор веществ, необходимых для роста клеток вне организма (аминокислоты, углеводы, витамины и др.), а также определенный солевой состав и рН. Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из эмбриональных тканей человека, кур, мышей, овец, свиней, кроликов, морских свинок и других животных, а также почечных клеток взрослых обезьян. Эмбриональные ткани обладают большей потенцией к росту, чем ткани взрослых животных. Перевиваемые культуры представляют собой штаммы клеток нормальных тканей человека (АО, Л1, FL, ППЧ, Rh), животных (СОЦ – сердце обезьян циномольгус, RК – почки кролика и др.) и ткани злокачественных опухолей (HeLa, Hep -1, Hep- 2, KB, Детройт-6 и др.). Их рост поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей. Так, например, культура клеток HeLa, полученная в 1950 г., к настоящему времени прошла тысячи генераций и используется во всех вирусологических лабораториях мира. В зараженных культурах ткани одни вирусы проявляют свое цитопатическое действие в течение нескольких дней (вирусы оспы, полиомиелита), другие – спустя 1-2 недели (аденовирусы, вирусы парагриппа). Цитопатический эффект выражается в различных изменениях морфологии клеток, пикнозе ядер, образовании симпластов (гигантские многоядерные клетки), в полной деструкции монослоя. Кроме того, вирусы в зараженных клетках вызывают образование внутриклеточных включений. Выявляют включения с помощью светового или люминисцентного микроскопа после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами, например, тельца Бабеши-Негри при вирусе бешенства, тельца Гварниери при вирусе натуральной оспы. О репродукции вирусов в культуре клеток судят также на основании образования «бляшек», которые представляют собой ограниченные участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое культур клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Подсчитав количество «бляшек», можно определить концентрацию вирусов в исследуемом материале. Кроме того, «бляшки» разных групп вирусов отличаются по размеру, форме, срокам появления. Целый ряд вирусов (гриппа, парагриппа) обладают гемадсорбирующими свойствами, т.е. адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых вирусов в культуре клеток можно использовать реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью. О репродукции вирусов в культуре клеток можно также судить по «цветной реакции». Она регистрируется по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде для культур клеток. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие рН среды и , соответственно, цвет индикатора. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет первоначальный цвет индикатора. Для культивирования вирусов в курином эмбрионе (5-12 дневные) вируссодержащий материал вводят в амниотическую, аллантоисную полость, желточный мешок, в мозг, тело эмбриона. Специфические поражения в куриных эмбрионах развиваются в виде очагового поражения, диффузного помутнения оболочек, отека с обильными язвами, участками некроза, кровоизлияний, пустул, пузырьков. Репродукцию вируса в курином эмбрионе обнаруживают реакцией гемагглютинации. Недостатком данного метода является то, что многие вирусы не размножаются в эмбрионах птиц. Культивирование вирусов проводят также в организме чувствительных лабораторных животных, особенно тех вирусов, которые не репродуцируются в культурах тканей и куриных эмбрионах. Взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интрацеребрально и др.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование лабораторных животных для культивирования вирусов также ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека. 3.8. Бактериофаги, их строение, классификация, применение. Бактериофаги – вирусы бактерий. История открытия бактериофага связана с именами Н.Ф. Гамалеи, наблюдавшего спонтанный лизис сибиреязвенных бактерий в 1898г. Английский бактериолог Ф. Туорт описал способность фильтрата стафилококков растворять свежую культуру этих же бактерий (1915г.). Французский ученый Ф.Д, Эррель подробно изучил взаимодействие фага и бактерий и сделал заключение, что открытый им литический агент является вирусом бактерий и назвал его «бактериофагом» - пожирателем бактерий. Бактериофаги широко распространены: они выявлены у большинства бактерий, а также у других микроорганизмов, например, у грибов и поэтому их часто называют фагами. Наиболее детально изучена структура крупных фагов, к которым относятся фаги E. Coli (Т2, Т4, Т6). Они состоят из головки икосаэдрического типа, в которой заключена или ДНК, или РНК. Большинство фагов содержат двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Хвостовой отросток имеет внутри полый цилиндрический стержень, сообщающийся с головкой, а снаружи – чехол, способный к сокращению наподобие мышцы. Чехол присоединен к воротничку, окружающему стержень около головки. Хвостовой отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с шипами от которых отходят нитевидные структуры – фибриллы. По морфологии фаги подразделяются на 6 групп: 1) фаги с длинным отростком, чехол которого сокращается; 2) фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается; 3) фаги с короткими отростками; 4) фаги с аналогом отростка; 5)фаги без отростка; 6) нитевидные фаги. Бактериофаги содержат группоспецифические и типоспецифические антигены, обладают иммуногенными свойствами, т.е. синтезируют специфические антитела в организме. По специфичности взаимодействия различают следующие бактериофаги: 1) поливалентные – взаимодействуют с родственными видами бактерий; 2) моновалентные – взаимодействуют с бактериями определенного вида; 3) типовые – взаимодействуют с отдельными типами бактерий данного вида. Взаимодействие фагов с бактериями может протекать: 1) по продуктивному типу – образуется фаговое потомство и бактерии лизируются; 2) по абортивному типу – фаговое потомство не образуется и бактерии сохраняют свою жизнедеятельность; 3) по интегративному типу – геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней. В зависимости от типа взаимодействия различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Адсорбция фагов на бактериальной клетке происходит при наличии комплементарных рецепторов в ее клеточной стенке. На бактериях, лишенных клеточной стенки бактериофаги не адсорбируются. Фаги, имеющие хвостовой отросток, прикрепляются к бактериальной клетке свободным концом отростка (фибриллами, базальной пластинкой). В результате активации АТФ чехол хвостового отростка сокращается и стержень с помощью лизоцима, растворяющего прилегающий фрагмент клеточной стенки как бы просверливает оболочку клетки. При этом ДНК фага, содержащаяся в его головке, проходит в форме нити через канал хвостового стержня и инъецируется в клетку, а капсид фага остается снаружи бактерии. Инъецированная внутрь бактерии нуклеиновая кислота подавляет биосинтез компонентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки фага, затем происходит самосборка частиц фага. В результате изменения внутриклеточного осмотического давления и действия фагового лизоцима происходит разрушение оболочки, лизис бактерии и выход фагов из нее. Умеренные бактериофаги в отличие от вирулентных взаимодействуют с чувствительными бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типам. При интегративном типе взаимодействия ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синхронно с геном размножающейся бактерии, не вызывая ее лизиса. ДНК бактериофага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий – лизогенной. Такое сосуществование бактерии и умеренного бактериофага называется лизогенией. Бактериофаги используют: 1) в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т.е. определения фаговара. Для этого применяют метод фаготипирования. На чашку с плотной питательной средой засевают «газоном» чистой культурой возбудителя и наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис. Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). Например, при возникновении массовых заболеваний стафилококковой этиологии в родильных домах, детских и больничных учреждениях большое значение приобретает выявление источников инфекции и установление эпидемиологических связей. Решение этой задачи возможно только методом фаготипирования стафилококков, подтверждающим идентичность микроорганизмов, выделяемых у больных, носителей и объектов внешней среды. Таким образом, при проведении эпидемиологического обследования метод фаготипирования бактерий дает возможность: 1) устанавливать или исключать предполагаемые источники инфекции; 2) прослеживать эпидемические связи; 3) отличать местные случаи от «привозных» и спородические заболевания от эпидемических. 2) фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый, стрептококковый фаги; комбинированные: колипротейный, пиобактериофаги. Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей, аэрозолей. 3) бактериофаги широко применяют в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК. Тесты по теме: 1. Требования, предъявляемые к питательным средам: а) плотные б) рН 5,0-5,2 в) рН 7,2-7,6 г) стерильные д) концентрация NaCl 0,5% 2. Концентрация агара в полужидких питательных средах: а) 0,1% б) 0,5% в) 1,0% г) 1,5-2,0% 3. К простым питательным средам относятся: а) кровяной агар б) пептонная вода в) сахарный бульон г) мясопептонный агар 4. К сложным питательным средам относятся: а) кровяной агар б) пептонная вода в) сахарный бульон г) мясопептонный агар 5. Среды, на которых лучше растет какой-то определенный микроорганизм: а) дифференциально-диагностические б) элективные в) полужидкие г) среды обогащения 6. Среды, стимулирующие рост определенного микроорганизма, но при этом ингибируют рост других: а) дифференциально-диагностические б) элективные в) полужидкие г) среды обогащения 7. Среды, служащие для изучения ферментативной активности бактерий: а) дифференциально-диагностические б) элективные в) полужидкие г) среды обогащения 8. Питательная среда, используемая при культивировании бактерий кишечной группы: а) среда Чистович б) среда Эндо в) среда Сабуро г) среда Вильсон-Блер 9. Питательная среда, используемая при культивировании стафилококков: а) среда Чистович б) среда Эндо в) среда Сабуро г) среда Вильсон-Блер 10. Питательная среда, используемая при культивировании грибов: а) среда Чистович б) среда Эндо в) среда Сабуро г) среда Вильсон-Блер 11. При культивировании анаэробов используют: а) среда Чистович б) среда Эндо в) среда Сабуро г) среда Вильсон-Блер 12. При культивировании вирусов используют: а) куриные эмбрионы б) простые питательные среды в) сложные питательные среды г) культуры клеток 13. Перечислите фазы размножения бактерий: а) первичная б) стационарная в) роста г) логарифмическая 14. Скопление микроорганизмов одного вида: а) колония б) чистая культура в) бактериофаг г) пигмент 15. Рост бактерий на жидких питательных средах: а) в виде пленки б) колоний в) сплошного налета г) осадка д) равномерного помутнения среды е) по «уколу» 16. К каким свойствам относится характер роста выделенной культуры на питательных средах: а) морфологические б) культуральные в) сахаролитические г) гемолитические д) протеолитические 17. Способность разрушать эритроциты на средах с кровью относится к свойствам: а) морфологические б) культуральные в) сахаролитические г) гемолитические д) протеолитические 18. Способность расщеплять белки на средах, содержащих желатин, молоко, сыворотку относится к свойствам: а) морфологические б) культуральные в) сахаролитические г) гемолитические д) протеолитические 19. Бактерии, использующие в питании неорганический углерод: а) гетеротрофы б) автотрофы в) фототрофы г) хемотрофы 20. Бактерии, использующие в питании органический углерод: а) гетеротрофы б) автотрофы в) фототрофы г) хемотрофы 21. Бактерии, получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций: а) гетеротрофы б) автотрофы в) фототрофы г) хемотрофы 22. Бактерии, получающие энергию за счет света: а) гетеротрофы б) автотрофы в) фототрофы г) хемотрофы 23. Бактерии, которые питаются мертвым органическим материалом: а) сапрофиты б) паразиты в) гетеротрофы г) факультативные паразиты 24. Бактерии, которые питаются за счет макроорганизма: а) сапрофиты б) паразиты в) гетеротрофы г) факультативные паразиты 25. Микроорганизмы, которые растут и размножаются в присутствии кислорода: а) облигатные аэробы б) микроаэрофилы в) строгие анаэробы г) аэротолерантные м/о д) факультативные анаэробы 26. Микроорганизмы, которые способны расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и в его отсутствии: а) облигатные аэробы б) микроаэрофилы в) строгие анаэробы г) аэротолерантные м/о д) факультативные анаэробы 27. Микроорганизмы, для которых кислород является токсичным: а) облигатные аэробы б) микроаэрофилы в) строгие анаэробы г) аэротолерантные м/о д) факультативные анаэробы 28. Вирусы, проникающие в бактерии, паразитирующие в них вплоть до гибели: а) ДНК-вирусы б) РНК-вирусы в) бактериофаги г) аденовирусы 29. Бактериофаги состоят: а) капсид б) головка в) хвостовой отросток г) базальная пластина 30. По специфичности взаимодействия бактериофаги различают: а) поливалентные б) продуктивные в) абортивные г) моновалентные 31. Взаимодействие фагов с бактериями при котором образуется фаговое потомство и лизис бактерий протекает по типу: а) абортивному б) интегративному в) продуктивному 32. Взаимодействие фагов с бактериями при котором геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует в ней протекает по типу: а) абортивному б) интегративному в) продуктивному 33. Фаги, взаимодействие которых с бактерией происходит либо по продуктивному, либо по интегративному типу называют: а) вирулентные б) поливалентные в) умереннные 34. Практическое применение фагов: а) для культивирования вирусов б) для лечения и профилактики инфекционных заболеваний в) в генной инженерии |