Честнова т. В., Смольянинова о. Л. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология
 Скачать 1.58 Mb.
|
|
Тема 2. Микроскопия. 2.1. Микроскопы, их устройство, техника микроскопирования микроорганизмов, правила обращения с микроскопом. Виды микроскопии. Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют световые микроскопы разных моделей («МБИ-1», «Биолам», «Бимам», «Микмед»). Для изучения более мелких объектов (вирусов) используют электронные микроскопы. Все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы. Механическая часть состоит из основания штатива (1), предметного столика (2), тубусодержателя (3), револьвера объектива (4), макровинта (5) - для перемещения тубуса, микровинта (6) – для тонкой фокусировки. Оптическая часть микроскопа состоит из объективов (7), окуляров (8) и осветительного устройства (9). Объективы представляют собой систему линз, одна из которых производит увеличение, а все остальные корригируют изображение. Окуляры состоят из двух линз (собирающей и глазной). Они увеличивают изображение, получаемое с помощью объектива. Осветительное устройство (зеркало, ирис-диафрагма и конденсор). При микроскопировании рекомендуется пользоваться следующими приемами: 1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа и закрепляют его боковыми зажимами. 2. Вращая револьвер, устанавливают объектив малого увеличения 8х. 3. Находят правильное освещение препарата. Для этого, пользуясь плоским зеркалом, или светильником направляют свет от источника в конденсор микроскопа, стремясь получить равномерное освещение поля зрения. Лучшее освещение подбирают поднятием или опусканием конденсора и при помощи диафрагмы. 4. Находят изображение при малом увеличении (объектив 8х), фокусируя макрометрическим винтом. 5. Без поднятия тубуса, вращая револьвер, заменяют объектив малого увеличения на объективы большого увеличения (40х, 90х). 6. При использовании иммерсионного объектива (90х) открывают диафрагму конденсора, чтобы увеличить свет. На препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Затем, глядя на препарат сбоку (для контроля, чтобы не раздавить стекло и не поцарапать фронтальную линзу объектива), очень осторожно погружают объектив 90х в масло почти до соприкосновения с поверхностью стекла, работая макрометрическим винтом. Далее очень медленно поднимают тубус при помощи макровинта до появления в поле зрения изучаемого объекта. Наконец, резкость изображения устанвливают микрометрическим винтом. При микроскопии в темном поле лучи, освещающие объект не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, а объект на его фоне кажется светящимся. Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора. С помощью фазово-контрастной микроскопии могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты. Для работы по методу фазового контраста, нужно кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Для этого конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конденсор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует светопольному конденсору. Современный микроскоп – это точный оптический прибор, требующий строгого соблюдения ряда правил при работе с ним. Хранить микроскоп нужно закрытым от пыли (под чехлом или под специальным стеклянным колпаком). Время от времени следует проверять чистоту и состояние оптики и протирать ее только снаружи с помощью волосяной кисточки или мягкой ткани, смоченной спиртом. Раз в год микроскоп должен просмотреть и при необходимости отремонтировать мастер-оптик. . 2.2. Методы приготовления и окрашивания микроскопических препаратов. Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми бактериями в окрашенном и неокрашенном состоянии. С целью изучения формы и подвижности бактерий микроскопию микроорганизмов можно проводить в живом состоянии без окрашивания. Для этого готовят мазки «раздавленная» и «висячая» капля и наблюдают их с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии. Приготовление мазка «раздавленная капля». На предметное стекло по центру наносят каплю или жидкой культуры или физ.раствора, в который вносят исследуемую культуру. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают с помощью покровного стекла. Затем на покровное стекло наносим каплю иммерсионного масла и микроскопируем. При фазово-контрастной микроскопии мы будем наблюдать подвижность и форму бактерий темного цвета на светлом фоне. При темнопольной микроскопии – подвижность и форму бактерий светлого цвета на темном фоне. Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют и после этого окрашивают. Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой–либо одной краски (или метиленового синего или фуксина). Сложные методы предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения). Предметные и покровные стекла, употребляемые для приготовления препаратов должны быть чистыми и хорошо обезжиренными (с помощью хозяйственного мыла). Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле физиологического раствора и размазывают по стеклу. Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют над пламенем спиртовки (горелки), держа стекло мазком вверх, и трижды проводят через пламя спиртовки. Время фиксации не должно превышать 5-6с. Кроме жара, для фиксации используют 96 град. спирт, погружая в него мазок на 15-20мин. После фиксации мазок готов к окрашиванию. Методика окраски по Граму. Особенностью окраски по Грамму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям. Микробы, входящие в группу грамположительных, например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Это объясняется строением клеточной стенки грамположительных бактерий. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Грамотрицательные бактерии (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний) образуют с генциановым фиололетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином в красный цвет. Клеточная стенка таких бактерий представлена тонким слоем пептидогликана.
Методика окраски по Бурри-Гинсу. Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.
Методика окраски по Ожешко. Этот метод служит для выявления у бактерий спор. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба, субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное – спора располагается на конце палочки.
Методика окраски по Цилю-Нильсену для кислотоустойчивых бактерий (возбудители туберкулеза и проказы). Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.
При окраске препаратов по методу Циля-Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново- красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя (синий). Тесты по теме: 1. Метод окрашивания для выявления капсул: а) Ожешко б) Бурри-Гинсу в) Граму г) Цилю- Нильсену д) Нейссеру 2. Метод окрашивания для выявления спор: а) Ожешко б) Бурри-Гинсу в) Граму г) Цилю- Нильсену д) Нейссеру 3. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются по методу: а) Ожешко б) Бурри-Гинсу в) Граму г) Цилю- Нильсену д) Нейссеру 4. Дифференциально-диагностическая окраска бактерий: а) Ожешко б) Бурри-Гинсу в) Граму г) Цилю- Нильсену д) Нейссеру 5. Перечислить грамположительные бактерии: а) стафилококки, клостридии б) кишечная палочка, сальмонелла в) стрептококки, гонококки 6. Перечислить грамотрицательные бактерии: а) менингококки, гонококки б) кишечная палочка, стафилококки в) стрептококки, сальмонеллы 7. Перечислить спорообразующие бактерии: а) сибирская язва, клостридии б) пневмококки, стрептококки в) клебсиелла, стафилококки 8. Перечислить капсулообразующие бактерии: а) пневмококки, клебсиелла б) сибирская язва, стрептококки в) шигеллы, сальмонеллы Тема 3. Физиология микроорганизмов. 3.1. Рост и размножение микроорганизмов. Фазы роста. Рост бактерий – это увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Рост клетки не беспределен. После достижения критических размеров клетка подвергается делению. Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Рост всегда предшествует размножению. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние. У большинства грамположительных бактерий деление происходит путем синтеза поперечной перегородки, идущей от периферии к центру. Клетки большинства грамотрицательных бактерий делятся путем перетяжки. Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. Репликация начинается в одной избранной области, называемой origin (начало), имеющей определенную последовательность нуклеотидов. Здесь может возникать одна или две репликативные вилки. В процессе репликации участвуют более 20 ферментов. Так как бактериальная ДНК двуспиральная, перед репликацией она должна быть разделена. В этом процессе участвуют ферменты хеликаза, которая расплетает двойную спираль и топоизомераза, которая предотвращает образование вторичных завитков. SSB-белок связывается с одноцепочечной ДНК, предотвращая повторное скручивание в двойную спираль. В результате образуется репликативная вилка. Синтез новых цепей ДНК осуществляется ферментом ДНК-полимиразой. Для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепи, полимеразе требуется затравка – праймер. Праймер представляет собой короткую нуклеотидную цепочку РНК, комплементарную матричной цепи, со свободным 3/ - концом. После того как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравка удаляется. Так как цепи ДНК в дуплексе антипарралельны, то направление расплетания двойной цепи совпадает лишь с направлением синтеза ДНК на одной матрице, которая называется ведущей. На комплементарной цепи ДНК синтезируется короткими фрагментами, которые впоследствии сшиваются в одну цепь ДНК-лигазами. Процесс репликации ДНК бактерии продолжается до тех пор, пока не удвоится вся ДНК. При внесении бактерий в питательную они растут и размножаются до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост и размножение прекращаются. Если не прибавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получаем статистическую бактериальную культуру. Фазы размножения бактерий:
3.2. Питательные среды, принципы их классификации, требования, предъявляемые к питательным средам, условия культивирования микроорганизмов. Основой бактериологических работ являются питательные среды, нередко определяя своим качеством результаты исследования. Основные требования, предъявляемые к питательным средам:
Для приготовления питательных сред используют продукты животного происхождения (мясо, рыба, кровь, яйца, молоко) и продукты растительного происхождения (картофель). Также используют синтетические питательные среды, составленные из химических соединений. Источником азота для бактерий служат простые аммонийные соединения, аминокислоты или пептоны; источником углерода – сахар, многоатомные спирты, органические кислоты. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCl, КН2РО4, К2НРО4. В зависимости от консистенции питательные среды могут быть: жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара. Агар- полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 оС, остывает при температуре 45-50 оС. Для полужидких сред агар добавляют в концентрации 0,5%, для плотных – 1,5-2%. Жидкие среды не содержат агар-агара. По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, мясопептонный бульон, мясопептонный агар, агар Хоттингера. Сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (сахарный, сывороточный, желчный бульоны, кровяной, сывороточный, желточно-солевой агары, среда Кита-Тароцци, Вильсона-Блера). В зависимости от назначения среды подразделяются: 1. Общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, кровяной агар). |