1. Диагностика туберкулеза.. Диагностика туберкулеза лабораторная (микро и молекулярнобиологическая, иммунологическая), рентгенологическая, эндоскопическая, морфологическая
 Скачать 77.5 Kb.
|
|
Перед началом лечения рекомендуется назначить молекулярно-генетические методы диагностики ЛУ МБТ хотя бы к изониазиду и рифампицину или только к рифампицину. На этапе выявления возбудителя туберкулеза, в случае получения методом ПЦР положительного результата на ДНК МБТ, выделенный из диагностического материала образец ДНК рекомендуется сразу же направить на тестирование ЛУ к ПТП первого и второго ряда одним из МГМ. В случае недостаточного содержания ДНК МБТ в диагностическом материале и, следовательно, невозможности получения результата исследования ЛУ МБТ при проведения прямого определения резистентности МГМ непосредственно из диагностического материала рекомендуется в дальнейшем провести молекулярно-генетическое тестирование ЛУ МБТ для соответствующей культуры, выделенной из этого материала при посеве его на жидкую или плотную питательные среды. С целью подтверждения результатов скрининговых исследований и обоснования назначения режима лечения в соответствии с лекарственной чувствительностью возбудителя используют культуральные методы определения ЛЧ МБТ к максимально широкому спектру противотуберкулезных препаратов. Определение лекарственной чувствительности МБТ к изониазиду, рифампицину, амикацину или канамицину, офлоксацинум настоятельно рекомендуются. На жидких и плотных питательных средах проводится определение ЛЧ МБТ к ПТП первого и второго ряда. СБОР ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА (Слайд 2) Эффективность лабораторных исследований в значительной степени зависит от качества диагностического материала. Соблюдение правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала и точное выполнение алгоритма обследования больных непосредственно влияет на результат и обеспечивает биологическую безопасность. Для исследования на туберкулёз используют разнообразный материал. В связи с тем, что туберкулёз лёгких - самая распространённая форма туберкулёзного поражения, основным материалом для исследования считают мокроту и другие виды отделяемого трахеобронхиального дерева: отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозоль-ингаляций; промывные воды бронхов; бронхоальвеолярные смывы; материал, получаемый при бронхоскопии, транстрахеальной и внутрилёгочной биопсии; аспират из бронхов, ларингеальные мазки, экссудаты, мазки из ран и др. Эффективность исследований возрастает, если проводят контролируемый сбор материала от больного. Для этого выделяют специально оборудованную комнату или закупают специальные кабины (с. 3). Сбор материала опасная процедура, поэтому собирать материал для исследования нужно, соблюдая правила инфекционной безопасности. Материал для исследования на микобактерии туберкулёза собирают в стерильные флаконы с плотно завинчивающимися крышками, чтобы предотвратить заражение окружающей среды и предохранить собранный материал от загрязнения. (Слайд 4) Флаконы для сбора диагностического материала должны отвечать следующим требованиям: •должны быть изготовлены из ударостойкого материала; •должны легко расплавляться при автоклавировании; •быть достаточного объёма (40–50 мл); •иметь широкое отверстие для сбора мокроты (диаметр не менее 30 мм); •быть удобными в обращении, прозрачными или полупрозрачными, чтобы можно было оценить количество и качество собранной пробы, не открывая крышку. (Слайд 5) Для получения оптимальных результатов исследования необходимо соблюдать следующие условия: •сбор материала проводить до начала химиотерапии; •материал для исследования необходимо собирать до утреннего приёма пищи и лекарственных препаратов; •для исследования желательно собрать не менее 3 проб утренней мокроты. Собирают мокроту в течение 3 дней подряд; •собранный материал необходимо как можно быстрее доставить в лабораторию; •в случае, когда доставить материал в лабораторию немедленно невозможно, его сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4 °С не более 48 ч; •при перевозке материала необходимо особенно тщательно следить за целостностью флаконов. Правильно собранная мокрота имеет слизистый или слизисто-гнойный характер. Оптимальный объём исследуемой порции мокроты составляет 3–5 мл. Мокроту собирают под надзором медицинского работника. Лицам, ответственным за сбор мокроты, необходимо следить за выполнением определённых правил: •нужно объяснить больному цели исследования и необходимость откашливать не слюну или носоглоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей. Этого можно добиться в результате продуктивного кашля, возникающего после нескольких (2–3) глубоких вдохов. Нужно также предупредить больного, что он должен предварительно прополоскать рот кипячёной водой, для удаления основной части вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатков пищи, затрудняющих исследование мокроты; •участвующий в сборе мокроты медицинский работник, помимо халата и шапочки, должен надеть маску, резиновые перчатки и резиновый фартук; •стоя позади больного, ему рекомендуют держать флакон как можно ближе к губам и сразу же отделять в него мокроту по мере её откашливания, при этом необходимо предусмотреть, чтобы поток воздуха был направлен в сторону от медработника; •по завершении сбора мокроты медицинский работник должен тщательно закрыть флакон крышкой и оценить количество и качество собранной мокроты. Затем флакон маркируют и помещают в специальный бикс для транспортировки в лабораторию. Если больной не выделяет мокроту, то накануне вечером и рано утром в день сбора материала нужно дать ему отхаркивающее средство: экстракт корней алтея лекарственного (мукалтин), бромгексин, амброксол и др. — или применить раздражающую ингаляцию, используя оборудование, установленное в комнате для сбора мокроты. Собранный таким образом материал не подлежит консервации и должен быть исследован в день сбора. Во избежание его «выбраковки» в лаборатории в направлении следует сделать специальную отметку. Предпосевная обработка диагностического материала отличается от обычных микробиологических методик. Это объясняется тем, что рост микобактерий происходит очень медленно (в течение 3-10 недель), генерация микобактериальной клетки составляет от 18 до 24 часов, а большинство пробдиагностического материала загрязнены быстрорастущими микроорганизмами. Их бурный рост на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому перед посевом диагностический материал обязательно подвергается так называемой предварительной обработке. Микобактерии, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизи. Предобработка материала перед посевом на питательные среды преследует две основные цели: максимально разжижить и гомогенизировать материал с целью концентрации микобактерий и «подавить» другие микроорганизмы с тем, чтобы в дальнейшем они не мешали росту микобактерий. При обработке для сохранения микобактериальной популяции используют реагенты, которые позволяют, с одной стороны, подавить быстрорастущие неспецифические микроорганизмы, а с другой максимально сохранить жизнеспособность микобактерий: NALC-NaOH (N-ацетил-L-цистеин-гидроксид натрия), трехзамещенный фосфорнокислый натрий, едкий натр, бензалкониум хлорид, растворы кислот. РЕЖИМЫ И КРАТНОСТЬ ОБСЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ При первичном, так называемом диагностическом, обследовании больного на туберкулёз необходимо в течение 2 или 3 дней исследовать не менее 3 порций мокроты, собранных под наблюдением медицинского персонала, что повышает результативность микроскопии. МИКРОСКОПИЯ МИКОБАКТЕРИЙ (Слайд 6) Микроскопия мокроты — сравнительно быстрый, простой и недорогой метод, который должен быть использован во всех случаях при подозрении на туберкулёз. Кроме того, это исследование проводят для оценки эффективности химиотерапии и для констатации выздоровления или неудачного исхода лечения при отсутствии результатов культурального исследования. Используют 2 метода микроскопического исследования: •метод прямой микроскопии, когда мазок готовят непосредственно из диагностического материала; •метод микроскопии осадка, подготовленного из обработанного деконтаминантами материала для культурального исследования. Первый метод используют в тех лабораториях, где проводят только микроскопические исследования (клинико-диагностические лаборатории общей лечебной сети). Лучшие результаты микроскопического исследования получают при концентрировании диагностического материала (например, центрифугированием). Чтобы обнаружить микобактерии туберкулёза с вероятностью 50% при проведении микроскопии, 1 мл мокроты должен содержать более 5000 микробных клеток. Мокрота пациентов с лёгочными формами туберкулёза обычно содержит значительное количество кислотоустойчивых бактерий, что позволяет уверенно выявить их при бактериоскопии. Диагностическую чувствительность этого метода можно повысить, если исследовать несколько образцов мокроты от одного пациента. Отрицательный результат бактериоскопического исследования не исключает диагноза туберкулёза, поскольку мокрота некоторых пациентов содержит меньше микобактерий, чем можно выявить с помощью микроскопии. Плохая подготовка мазков мокроты также может быть причиной отрицательного результата бактериоскопического исследования. Наиболее распространённый метод для выявления кислотоустойчивых микобактерий в мазке — окраска по Цилю–Нельсену. Метод основан на проникновении карболового фуксина в микробную клетку через мембрану, включающую в себя восково-липидный слой, при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия фенола. Регистрируют результаты, указывая количество обнаруженных кислотоустойчивых микобактерий (КУМ). (Слайд 7) Помимо данной методики, применяют окраску флюорохромами для люминесцентной микроскопии, что позволяет достичь наилучших результатов. Применение этого метода повышает эффективность микроскопии на 10–15%. Бактериоскопические методы обладают довольно высокой специфичностью (89–100%). Около 97% положительных результатов, полученных любым методом микроскопии, однозначно подтверждаются результатами посева. (Слайд 8) Необходимо отметить, что при микроскопическом исследовании мазка патологического материала нельзя определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых микобактерий. Метод микроскопии позволяет дать заключение лишь о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микроорганизмов, что объясняется существованием в природе большого числа морфологически сходных с микобактериями туберкулёзного комплекса нетуберкулёзных кислотоустойчивых микроорганизмов. КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ МЕТОД Метод посева, или культуральный метод, отличается большей чувствительностью, чем микроскопия мазков, и имеет перед последним ряд преимуществ. Он позволяет обнаруживать несколько десятков жизнеспособных микобактерий в исследуемом материале и имеет большую диагностическую ценность. Это особенно важно при исследовании материала от впервые выявленных или леченных больных, выделяющих небольшое количество микобактерий. По сравнению с микроскопией, культуральное исследование позволяет увеличить число выявленных больных туберкулёзом более чем на 15–25%, а также верифицировать туберкулёз в более ранних стадиях, когда заболевание ещё хорошо поддаётся лечению. Очень важным преимуществом культурального исследования считают возможность получения культуры возбудителя, которая может быть идентифицирована и изучена в отношении лекарственной чувствительности, вирулентности и других биологических свойств. К недостаткам методов культивирования следует отнести их длительность (срок ожидания материалов достигает 10 нед), более высокую стоимость, сложность обработки диагностического материала. (Слайд 9) Интенсивность роста микобактерий обозначают по следующей схеме: (+) — 1−20 КОЕ в пробирке (скудное бактериовыделение); (++) — 20−100 КОЕ в пробирке (умеренное бактериовыделение); (+++) — >100 КОЕ в пробирке (обильное бактериовыделение). При лабораторной диагностике туберкулёза недостаточно дать ответ, констатирующий, обнаружены ли или нет тем или иным методом микобактерии. Необходимо иметь детальное представление об объёме и характере микобактериальной популяции, её составе и свойствах. Именно эти данные позволяют правильно интерпретировать состояние процесса, планировать тактику и своевременно корригировать лечение. В последние годы для ускорения роста микобактерий предложены питательные среды на агаровой основе с различными ростовыми добавками и применением специальной газовой смеси. Для получения роста микобактерий на этих средах при культивировании создают атмосферу с повышенным содержанием углекислого газа (4−7%). С этой целью используют специальные СО2-инкубаторы. Однако наибольшее развитие получили автоматизированные системы культивирования микобактерий: MGIT-ВАСТЕС-960 и МВ/Васt. (Слайд 10) Одна из таких систем - система MGIT (mycobacteria growth indicating tube), которая относится к разработкам высоких технологий и предназначена для ускоренной бактериологической диагностики туберкулёза и определения чувствительности микобактерий к препаратам первого ряда и некоторым препаратам второго ряда. MGIT ориентирована на использование её в составе прибора BACTEC-960. Культивируют микроорганизмы в специальных пробирках с жидкой питательной средой на основе модифицированной среды Middlebrook-7H9. Для стимуляции роста микобактерий и подавления роста посторонней микрофлоры используются добавки роста MGIT GrowthSupplement и смесь антибактериальных препаратов PANTA. Кроме того на дне пробирки содержится бескислородный флюорохром. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флуорохрома. Регистрацию роста микроорганизмов осуществляют оптически. В её основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении кислорода микобактериями в процессе роста. Кислородзависимый флюорохромный краситель содержится на дне специальной пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к уменьшению количества кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC-960. Интенсивность свечения регистрируют в единицах роста (GU - growthunits). Данные роста заносятся в компьютер, где их можно сохранить, автоматически а — незначительное или полное отсутствие свечения (отрицательный результат); б — ярко-оранжевое свечение на дне пробирки и оранжевое отражение на мениске жидкости (положительный результат). Компьютерный анализ кривых роста может дать информацию о наличии различных пулов микобактерий, в том числе нетуберкулёзных, а также помогает оценить ростовые свойства микобактерий. Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT -960/320 перед культуральными исследованиями на ППС обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований. Скорость получения роста микобактериальных культур гораздо выше на жидких средах, чем на ППС – до получения положительного результата в системе проходит12-22 дня. Отрицательный результат выдается через 42 дня культивирования на жидких средах. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ С учётом того, что используемые питательные среды не являются строго селективными, последующую дифференциацию выделенных микобактерий признают обязательной. Необходимость дифференциации микобактерий обусловлена рядом особенностей патологических процессов, вызываемых представителями рода: различным течением и исходом туберкулёза и микобактериозов, наличием природной лекарственной резистентности к некоторым противотуберкулёзным препаратам. Признано, что первичную идентификацию микобактерий комплекса M. tuberculosis от нетуберкулёзных микобактерий осуществляют по следующим характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах, пигментообразование, морфология колоний, наличие кислотоустойчивости и температурный оптимум роста. Современная дифференциация МБТК и НТМБ может проводиться при помощи молекулярных методов с применением метода иммунохроматографии и методов, основанных на молекулярно-генетических технологиях. Методы, идентификации, основанные на молекулярно-биологических тестах (ПЦР и иммунохроматографический), имеют преимущество в специфичности и быстроте анализа по сравнению с культуральными и биохимическими методами. Молекулярные методы дифференциации МБТК от НТМБ основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбудителя. Ряд методов направлен только на то, чтобы дифференцировать МБТК от НТМБ. Тест-системы, основанные на амплификации видоспецифических фрагментов ДНК, предназначены для точной видовой идентификации возбудителя как в диагностическом материале, так и в культурах микобактерий. К методам, дифференцирующим МБТК от НТМБ, относится ПЦР, выявляющая вставочную последовательность ДНК IS6110, присутствующую только у МБТК, и иммунохроматографический тест, выявляющий антиген микобактерий туберкулеза МРТ64. Идентификация микобактерий до вида может проводиться также с помощью секвенирования, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии, результаты которых основаны на выявлении уникальных для каждого вида микобактерий структур. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ Определение спектра и степени чувствительности микобактерий к противотуберкулёзным препаратам имеет важное клиническое значение, а также для эпидемиологической оценки распространения туберкулёза с лекарственной устойчивостью. Кроме того, мониторинг лекарственной устойчивости позволяет оценивать эффективность противотуберкулёзной программы в целом, являясь интегральным показателем работы всех составляющих противотуберкулёзных мероприятий.(р. 13). Кратность и сроки определения лекарственной чувствительности: •до начала лечения однократно для определения стратегии и тактики лечения; •при изоляции от больного культур из различного материала (мокрота, БАЛ, моча, экссудаты, ликвор и др.) исследуются все выделенные штаммы; •в конце интенсивной фазы лечения при отсутствии клинико-рентгенологической динамики; •при необходимости изменения схемы лечения. Согласно международным рекомендациям ВОЗ для определения ЛЧ МБТК в качестве основных используют фенотипические методы, т.е. культивирование МБТК в присутствии ПТП: модифицированный метод пропорций на жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микобактериц для препаратов первого и второго ряда; метод пропорций для препаратов первого и некоторых препаратов второго ряда на ППС Левенштейна-Йенсена. Лекарственная устойчивость, т.е. возможность размножаться в присутствии лекарственных препаратов, является фундаментальным биологическим свойством не только для МБТ. Принято уровень устойчивости некоего штамма в целом выражать той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение МБТК (по числу колоний на ППС). Лекарственно-устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие. Для ПТП установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТК в условиях макроорганизма. Показатель роста микобактериального пула (КОЕ), выраженный в абсолютных или относительных единицах, на питательной среде, содержащей ПТП, превышение числа КОЕ считается наличием признака устойчивости МБТК. В основе теста на ЛЧ МБТ в автоматизированной системе ВАСТЕС лежит модифицированный метод пропорций. В процессе определения происходит сравнение скорости роста МБТ – в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора ВАСТЕС, который автоматически интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности к препарату. Длительность проведения ТЛЧ в автоматической системе обычно составляет от 9 до 12 дней. В настоящее время этот метод является золотым стандартом определения ЛЧ МБТ. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА И ЛУ МБТ Современная диагностика инфекционных заболеваний немыслима без быстрых и точных молекулярно-генетических методов выявления, идентификации и установления ЛУ возбудителей. В основе практически всех молекулярных подходов к решению этой задачи лежит ПЦР в различных вариантах. |