1. Диагностика туберкулеза.. Диагностика туберкулеза лабораторная (микро и молекулярнобиологическая, иммунологическая), рентгенологическая, эндоскопическая, морфологическая

Название	Диагностика туберкулеза лабораторная (микро и молекулярнобиологическая, иммунологическая), рентгенологическая, эндоскопическая, морфологическая
Дата	19.10.2022
Размер	77.5 Kb.
Формат файла
Имя файла	1. Диагностика туберкулеза..docx
Тип	Документы #742670
страница	3 из 4

1 2 3 4

(Слайд 11) К методам молекулярной биологии в диагностике инфекционных заболеваний относят, в основном, методы, основанные на манипулировании с геномными материалами бактериальных и вирусных возбудителей с целью выявления специфического генетического материала — участков ДНК с нуклеотидной последовательностью, специфической в отношении данного вида или штаммов возбудителя, для анализа специфических последовательностей ДНК в генах, определяющих чувствительность возбудителя к определённым лекарственным веществам, а также для анализа функциональной активности определённых генов возбудителя. Молекулярно-биологические методы получили большое распространение в научных исследования и практическое применение в диагностике и контроле различных бактериальных и вирусных инфекций после открытия в 1983 г. Кэрри Мюллисом (лауреат Нобелевской премии, 1993) полимеразной цепной реакции. В 1995 г. в ЦНИИТ была создана лаборатория молекулярно-генетических методов исследования, в которой начали выполняться анализы на выявление ДНК МБТ.

ПРИНЦИПЫ И ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

ПЦР позволяет амплифицировать (размножить) в пробирке нуклеотидную последовательность (фрагмент ДНК возбудителя) в течение нескольких часов в миллионы раз. Проведение реакции при наличии единичных цепей ДНК определяет исключительно высокую чувствительность анализа.

Нуклеотидная последовательность определённых участков в цепи ДНК определяет генетическое своеобразие микроорганизма, что объясняет высокую специфичность ПЦР.

Значение этого метода для обнаружения и исследования характеристик микобактерий туберкулёза обусловлено биологическими особенностями микроорганизма, обладающего очень медленным ростом: время удвоения ДНК микобактерий туберкулёза при их культивировании составляет 12–24 ч.

Принцип метода ПЦР состоит в амплификации — многократном, в миллионы раз, умножении участков специфической последовательности ДНК в пробирочном микрообъёме при циклическом повторении следующих трёх стадий реакции, каждая из которых проходит в различном температурном режиме:

I стадия — денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании с расхождением её цепей;

II стадия — комплементарное связывание (гибридизация) праймеров (затравочных олигонуклеотидов) с концевыми участками цепей строго специфического, избранного для умножения фрагмента ДНК;

III стадия — достройка цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

Для определения генома микобактерий туберкулёзного комплекса наиболее эффективной мишенью амплификации в большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в большинстве штаммов микобактерий туберкулёза имеет в геноме значительное число (10–20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность аналилиза.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА

Задачи молекулярно-генетических методов определения лекарственной чувствительности или устойчивости микобактерий туберкулёза сводятся к выявлению мутаций в определённых нуклеотидных последовательностях известных генов. Основные методы основаны либо на прямом прочитывании (секвенировании) этих последовательностей после амплификации, либо на гибридизации биотин-меченых фрагментов ДНК, амплифицированных в ходе ПЦР с ДНК-зондами.

Основной алгоритм проведения этого исследования следующий. После выделения ДНК из клинического образца или культуры микобактерий необходимо провести ПЦР для амплификации соответствующих фрагментов rpoB гена, ответственного за лекарственную чувствительность к рифампицину, или katG и inhA генов, кодирующих белки микобактерий, ответственные за чувствительность к изониазиду. Результаты ПЦР оценивают с помощью гельэлектрофореза, при котором подтверждают получение соответствующих фрагментов ДНК искомой длины.

ПЦР в режиме реального времени (ПЦР РВ)

Результаты амплификации учитываются непосредственно во время проведения реакции по накоплению флуоресцентного сигнала. Накопление флуоресцентного сигнала прямо пропорционально накоплению продуктов амплификации. В реакционную смесь добавлен специфический зонд, связанный с флуорофором и гасителем флуоресценции.

По сравнению с традиционными микробиологическими методами выявления возбудителя туберкулеза ПЦР РВ имеет ряд существенных преимуществ:

Время проведения анализа. ПЦР требует минимального времени проведения анализа, результат можно получить в день сдачи материала.
Чувствительность. ПЦР превосходит по чувствительности все классические методы. Чувствительность ПЦР зависит от производителя набора реагентов и в среднем составляет не более 10 – 50 микобактериальных клеток в образце, взятом на анализ.
Специфичность. Специфичность ПЦР наиболее высокая из всех применяемых методов – 99,9%.
Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одного образца.
Возможность использовать в качестве образца абсолютно любой биологический материал. Выделение ДНК для последующей амплификации можно проводить из разнообразного материала – любых жидкостей человеческого организма, биоптатов и т.д. Следует отметить, что в качестве исследуемого материала для ПЦР могут служить и объекты окружающей среды – почва, вода, воздух.
Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых и некультивируемых форм микроорганизмов, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
Возможность проведения количественного и полуколичественного анализа. ПЦР-РВ позволяет рассчитать число клеток в образце, т.е. определить массивность бактериовыделения.
Стоимость. Отечественные наборы реагентов для выявления ДНК МБТ имеют низкую стоимость, сравнимую с со стоимостью микроскопии или посева на ППС.
Автоматическая интерпретация результатов. Получение результатов ПЦР-РВ предполагает автоматический анализ результатов, что снижает возможность ошибки персонала.
Возможность автоматизации всех этапов анализа, что снижает риск контаминации практически до нуля, снижает трудозатраты и увеличивает поток выполняемых анализов.
Безопасность работы персонала. Предобработка нативного диагностического материала инактивирующими реагентами предотвращает возможность заражения персонала во время работы.

Современная бактериологическая лаборатория с помощью метода ПЦР может решать практически все возложенные на нее задачи:

Обнаружение возбудителя туберкулеза в диагностическом материале, направленном на исследование.
Идентификация возбудителя, дифференцирование от нетуберкулезных микобактерий и посторонней микрофлоры. Если в диагностическом материале выявлены НТМБ, то проведение их идентификации до вида.
Определение ЛУ МБТ. Молекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ по быстроте получения результатов стоят на первом месте, они позволяют получить за 1 – 3 дня с момента поступления больного в стационар точные данные о наличии у туберкулеза с МЛУ, т.к. наблюдается высокая сходимость результатов между фенотипической и генотипической устойчивостью для рифампицина и изониазида.

Определять мутации в геноме МБТ, отвечающих за возникновение ЛУ, необходимо всем категориям больных при поступлении в стационар и для последующего контроля химиотерапии (отслеживать нарастание ЛУ). После получения результатов молекулярно-генетического определения ЛЧ, по крайней мере, к трем препаратам (рифампицину, изониазиду и фторхинолонам), врач может скорректировать схему противотуберкулезной химитерапии.

Особое внимание уделяется исследованиям молекулярных механизмов возникновения ЛУ к ПТП – давно применяемым и вновь открытым. В основе действия практически всех антибиотиков лежит связывание их с жизненно необходимыми белками бактериальных клеток и блокирование их функций. Белки кодируются генами. Если в гене бактерий возникнет мутация, структура синтезируемого белка изменяется. Препарат больше не может связаться с таким измененным белком и не блокирует его. Таким образом, мутации в геноме МБТ ответственны за возникновение ЛУ.

Мутации в геноме микобактерий возникают спонтанно и связаны с ошибками редупликации ДНК при делении клеток. Мутировавшие клетки не имеют преимуществ перед немутирававшими. Наоборот, некоторыми работами показано, что такие мутанты имеют сниженную жизнеспособность. Однако, при селективном давлении антибиотиков, т.е. при лечении больного, мутантные клетки, которые не погибают от препаратов, сразу получают большие преимущества. В то время как популяция немутировавших микобактериальных клеток вымирает, мутанты выживают и размножаются в организме. В настоящее время выявлены замены в генах МБТК, ответственных за устойчивость к противотуберкулезным препаратам.

Детекция этих мутаций лежит в основе определения ЛУ МБТ молекулярно-генетическими методами.

(Слайд 12) На территории РФ зарегистрированы и применяются следующие наборы реагентов для определения ЛУ МБТ молекулярно-генетическими методами:

- ПЦР-РВ для определения ЛУ МБТ к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам;

- ПЦР-РВ для выявления ДНК МБТ с одновременным определением ЛУ к рифампицину из клинического материала (картриджная технология);

- ПЦР с дальнейшей гибридизацией продуктов на стриповых мембранах для определения ЛУ к рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам, аминогликозидам и циклическим пептидам (стриповая технология);

- ПЦР с дальнейшей гибридизацией продуктов на биологических микрочипах для определения ЛУ к рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам, аминогликозидам и циклическим пептидам (биочиповая технология).

Методы лучевой диагностики

Во фтизиатрии применяют рентгенологические и ультразвуковые методы, радионуклидное сканирование, магнитнорезонансную томографию. В дифференциальной диагностике может иметь значение и позитронная эмиссионная томография (ПЭТ).

(Слайд 13) Рентгенологические методы Рентгенографию легких начинают с обзорного снимка в передней прямой Затем делают обзорные снимки в боковой проекции — правый и левый. Рентгенограммы в боковых проекциях необходимы для определения локализации патологического процесса в долях и сегментах легких, выявления изменений в междолевых щелях и в легких за тенями сердца и диафрагмы. (сл 23)

Рентгеноскопию производят, как правило, с использованием электронно-оптического усиления рентгеновского изображения и рентгенотелевидения. Применяют этот метод после рентгенографии по определенным показаниям. Таковыми являются контроль во время прицельных снимков и диагностических пункций, рентгенобронхологических, ангиографиче* ских и фистулографических исследований.

(Слайд 14) Компьютерная томография (КТ) — метод рентгенологического исследования, который получил всеобщее признание и применяется во всех областях клинической медицины. КТ обеспечивает получение изображения поперечных слоев человеческого тела (аксиальная проекция). Рентгеновская трубка вращается вокруг продольной оси тела пациента. Тонкий пучок лучей проходит под разными углами через исследуемый слой и улавливается многочисленными сцинтилляционными детекторами, которые движутся вместе с трубкой. Разная плотность тканей, через которые проходят рентгеновские лучи, обусловливает различное изменение интенсивности их пучка. Оно с высокой точностью регистрируется детекторами, обрабатывается компьютером и трансформируется в изображение исследуемого поперечного слоя на телевизионном экране. Таким образом, КТ представляет собой не снимок в обычном понимании этого слова, а рисунок, сделанный компьютером на основе математического анализа степени поглощения рентгеновских лучей тканями различной плотности (вычислительная томография). (Слайд 15) Компьютерные томографы с обычной технологией сканирования предполагают пошаговое движение стола с пациентом и остановку рентгеновской трубки после каждого цикла вращения. Они позволяют исследовать поперечные слои толщиной от 2 до 10 мм. Сканирование одного слоя продолжается несколько секунд. Значительное усиление контрастности удается получить при внутривенном введении рентгеноконтрастного раствора. Аксиальные (поперечные) изображения можно с помощью компьютера реконструировать в прямые, боковые и косые томограммы исследованной области. Яркость и контрастность изображения можно изменять в больших пределах. При КТ органов дыхания выполняют 6—12 стандартных срезов. Все результаты параллельно с изображением на телевизионном экране хранятся в памяти компьютера и могут быть воспроизведены в виде рисунка на поляроидной фотобумаге или рентгеновской пленке.

(Слайд 16) Существенной возможностью КТ является количественная оценка плотности исследуемых тканей и сред в условных единицах по шкале Хоунсфилда. Плотность воды по этой шкале составляет 0, воздуха (—)1000 ед., легкого (+)600 ед., кости (+)1000 ед.

Магнитно-резонансная томография (МРТ). Многие достоинства МРТ являются основанием для ее использования приисследовании головного и спинного мозга, костей и суставов, крупных сосудов грудной полости, сердца и других внутренних органов. Одним из важных достоинств метода является отсутствие лучевой нагрузки на пациента и медицинский персонал. Пациента укладывают на стол томографа. Исследуемую область тела помещают в сильное магнитное поле. Оно разворачивает протоны в своем направлении и создает в тканях магнитный момент, ориентированный параллельно внешнему магнитному полю. При воздействии импульсов, которые направляют перпендикулярно к магнитному полю из радиопередающей катушки, суммарный магнитный вектор изменяет направление и начинает вращаться вокруг новой оси. Результатом является индукция электрического тока в приемной катушке — появление магнитно-резонансного Сигнала. Он преобразуется специальным анализатором и передается на экран черно-белого монитора.

Ангиопулъмонография заключается в контрастировании и рентгенологическом исследовании легочной артерии и ее ветвей. Существуют две основные методики ангиопульмонографии — общая и селективная.

При общей ангиопульмонографии контрастный раствор вводят через катетер в вену руки, верхнюю полую вену или в полость правых отделов сердца. Рентгеновские снимки производят серийно на специальном ангиографическом аппарате. Этот метод требует значительного количества контрастного вещества (50—60 мл) и обычно не обеспечивает четкого изображения легочных сосудов, особенно при патологических изменениях в легких. Ампутация сосудов не всегда отражает их истинное состояние.

Селективная ангиопульмонография технически несколько сложнее, но используется чаще. Ее осуществляют после катетеризации соответствующей ветви легочной артерии. Серийные снимки делают после введения 10—12 мл раствора контрастного вещества. Обычно селективную ангиопульмонографию сочетают с регистрацией давления в малом круге кровообращения и исследованием газов крови. Показания к ангиопульмонографии ограничены. Ее применяют для диагностики тромбоза и эмболии легочной артерии, а также для выяснения способности к расправлению длительно коллабированного легкого — по состоянию сосудов судят о степени пневмофиброза.

Бронхиальная артериография заключается в катетеризации, контрастировании и рентгенографии бронхиальных артерий и их ветвей.

(Слайд 17) Бронхография. Контрастное рентгенологическое исследование бронхов осуществляют под местной анестезией в виде позиционной (ненаправленной) или селективной (направленной) бронхографии.

Плеврография позволяет контрастировать и уточнить границы гнойной полости у больных с эмпиемой плевры.

Фистулографию используют для обследования больных с различными торакальными и торакобронхиальными свищами.

Ультразвуковые методы, в частности ультразвуковое сканирование, отличаются безопасностью, возможностью проведения многократных исследований, высокой разрешающей способностью. Во фтизиатрической практике ультразвуковые методы полезны для точного определения и контроля за размерами периферических лимфатических узлов (шейных, подмышечных, паховых). С помощью ультразвука можно определить наличие жидкости в плевральной полости, так как при ее наличии между париетальной плеврой и легким отмечается гипоэхогенная зона. Ультразвуковой контроль позволяет выбрать точку для пункции полости плевры. После пневмонэктомии динамическое определение уровня жидкости в плевральной полости часто может заменить рентгенологическое исследование. Важное и часто решающее значение ультразвуковая диагностика имеет при обследовании мужчин и женщин с подозрением на туберкулез органов мочеполовой системы. Она необходима также для контроля за динамикой процесса при лечении фтизиоурологических и фтизиогинекологических больных.

Радионуклидные (радиоизотопные) методы имеют ведущее значение для регионарной оценки вентиляции и кровотока в легких. Они основаны на ингаляционном или чаще внутривенном введении радиофармацевтических препаратов, меченных гамма-излучающими радионуклидами. Это ксенон-воздушная смесь (¹³³Хе), макроагрегат альбумина (^l31I или ^99mТс), индия цитрат (^133mIn), микросферы альбумина (^99mТс или ^l33mIn) и др. Регистрацию распределения введенного препарата производят с помощью сцинтилляционной гамма-камеры с компьютером. При этом возможна как статическая, так и динамическая сцинтиграфия в передней, задней и боковых проекциях.

Эндоскопия

Для бронхоскопии используют гибкий бронхоскоп со стек* ловолоконной оптикой — фибробронхоскоп. По специальным показаниям, обычно связанным с некоторыми эндоскопическими вмешательствами, используют жесткий (металлический) бронхоскоп.

1 2 3 4