биопленки. дипломка. Дипломная работа Биопленки. Методы изучения
 Скачать 267.41 Kb.
|
1 2 2.1 Методы культивирования биоплёнок В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок. Основное направление этих исследований связано с разработкой методов культивирования микроорганизмов в динамических (имитация естественных условий образования биопленок) и статических условия. К динамическим можно отнести методы с использованием лабораторных ферментеров. Общая суть методов заключается в инокулировании микроорганизмов в планктонной фазе развития в жидкие питательные среды, которые циркулируют в закрытой системе. Таким образом, создаются условия для постоянного потока жидкости, содержащей микроорганизмы. Первоначальная адгезия микроорганизмов происходит на поверхности системы фильтров и/или на внутренних частях ферментера. В последующем адгезированные микроорганизмы образуют матрикс биопленки. Другим примером динамического метода можно считать культивирование в аппарате Робинсона и в его различных модификациях. В этом методе используют аппарат сложной конструкции, обеспечивающий ток питательной среды, которая соприкасается с пластинами из искусственного или биологического материала, на поверхности которого находятся адгезированные, физиологически адаптированные клетки микроорганизмов. В результате в условиях постоянного доступа питательных веществ и аэрации образуется биопленка. Проточный метод можно отнести к микроциркуляторным методам. Биопленка микроорганизмов образуется на поверхности силиконовых трубок проточных ячеек (flow cells), через которые с помощью помпы постоянно подается питательная среда. Такой метод позволяет моделировать процессы образования биопленки на абиотических объектах, например на внутрисосудистых катетерах. Основным преимуществом динамических методов формирования биопленок является максимальное приближение к условиям живых систем. Постоянное поступление питательных веществ и удаление продуктов жизнедеятельности микроорганизмов позволяет значительно интенсифицировать процесс формирования биопленки. Условия, обеспечивающие жизнедеятельность микроорганизмов в биопленке, полученной такими методами, стандартизированы, а влияние посторонних факторов минимизировано. В модификациях метода Робинсона и в проточном методе возможно изучение процесса образования или подавления биопленок в реальном времени с использованием световой микроскопии. К недостаткам данной группы методов можно отнести их ограниченное использование в связи с большими объемами потребления питательных сред, сложной конструкцией оборудования, затруднением стерилизации внутренних поверхностей аппаратов, низкой производительностью методов, высокой стоимостью эксплуатации. Вторая группа методов основана на создании статических условий культивирования микроорганизмов. Наиболее часто используемой техникой, среди данной группы, является метод с применением 96-луночных пластиковых планшетов в различных модификациях. Метод основан на способности бактерий формировать биоплёнки на поливинилхлоридном пластике(ПВХ) Суть метода можно охарактеризовать следующим образом: суспензия бактерий вносится в лунки планшета, после инкубации в оптимальных условиях планктонная фаза популяции бактерий удаляется вместе с питательной средой, образовавшиеся биопленки окрашивают кристалл виолетом и проводят количественный учёт связанного красителя в спектрофотометре, что позволяет проводить количественные сравнения способности образования биоплёнки разными штаммами. Этот метод до сих пор не потерял своей значимости, однако научный интерес отечественных исследователей к нему в последнее время значительно снизился, а практическое значение так и не получило должной оценки в нашей стране. В первую очередь, это связано с тем, что для этого метода не разработаны стандарты, позволяющие унифицировать его в разных лабораториях. Уже в ранних работах была отмечена разная адгезивная способность одних и тех же штаммов микроорганизмов к различным поверхностям. Данный факт связан с тем, что все микроорганизмы обладают способностью прикрепляться к органическим и неорганическим поверхностям, а адгезия является пусковым механизмом в развитии инфекционного процесса. Адгезию разделяют на неспецифическую и специфическую. Первая обусловлено физикохимическими процессами взаимодействия бактерий с поверхностью: электростатические и гидрофобные взаимодействия, броуновское движение. Неспецифическое прикрепление осуществляется к биотическим и абиотическим объектам и в большей степени обратимо. Специфическое прикрепление происходит после молекулярных взаимодействий между молекулами-адгезинами и рецепторами клеток хозяина. Немаловажную роль в адгезии микроорганизмов к различным поверхностям играют также электрические заряды. Бактериальная поверхность заряжена отрицательно, причем у грамположительных микроорганизмов это обусловлено наличием в клеточной стенке тейхоевых и липотейхоевых кислот, а у грамотрицательных - присутствием кислых липополисахаридов и белков. Таким образом, использование планшетов даже одного производителя может приводить к получению значительно различающихся результатов, что обусловлено их физико-химическими особенностями. Так, например, некоторые производители выпускают планшеты со специфическим связыванием углеводов, аминов, ДНК, сульфгидрильных групп; со специальной обработкой поверхности для клеточной адгезии, в том числе и покрытые полилизином для белковой кристаллизации. Необходимо учитывать тот факт, что к поверхности лунок планшетов микроорганизмы прикрепляются за счет неспецифических факторов. Помимо особенностей поверхности планшета, на формирование биопленок в данной группе методов влияют состав питательных сред (микронутриентный и электролитный) и степень аэрации. Одной из модификаций планшетного метода исследования формирования биопленок является ALI-метод (air-liquid interface). Его суть заключается в культивировании микроорганизмов в планшете, который находится под углом 30°–50° таким образом, чтобы мениск жидкой питательной среды соприкасался с серединой дна лунки. Середина лунки является наиболее оптически чистой зоной планшета. В месте соприкосновения жидкой питательной среды с этой зоной формируются максимально благоприятные условия для формирования биопленки. Этот метод позволяет визуализировать биопленки без необходимости использования красителей с помощью фазово-контрастной микроскопии, а мониторинг можно проводить в режиме реального времени. Его недостатком является возможное уменьшение объема питательной среды в лунке и, как следствие, высыхание места контакта адгезированных микроорганизмов со средой. По этой причине, возникает необходимость постоянного внесения питательной среды в лунки, либо уменьшения времени инкубации. В связи с возрастающим интересом стоматологов к проблеме биопленок был разработан метод их формирования на гидроксиапатитовых дисках. Материал дисков был выбран из-за высокой пористости и схожести его строения с тканями зуба. В дальнейшем метод был стандартизирован и в нем стали использовать поликарбонатные диски. Суть метода заключается в следующем: на поверхность плотной питательной среды помещают диск, на который наносят суспензию исследуемой культуры. Питательные вещества поступают к клеткам путем диффузии через поры поликарбонатного диска. Таким образом, это единственный из разработанных статических методов, при котором к биопленке питательные вещества поступают из плотной среды. Этот метод рекомендуется авторами исследований как основной для выявления влияния антимикробных веществ на формирование биопленок. Отдельно следует указать на метод, разработанный D.E. Kadouri с соавт., который занимает промежуточное положение между статическими и динамическими методами. В методе используются 6-луночные планшеты, к каждой лунке которых подведена система подачи и отвода питательной среды. После определенного времени инкубации, достаточного для адгезии бактерий на поверхности лунки, подключается система микроциркуляции, которая обеспечивает оптимальное поступление питательных веществ к формирующейся биопленке. 2.2 Генетические методы изучения биоплёнок Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле любого процесса, используются методы направленного и ненаправленного (инсерционного) мутагенезов. Для выяснения механизмов инициации образования биопленок R. Kolter с соавт. описали мутанты, дефектные в отношении образования биопленок, полученные с помощью транспозонного мутагенеза, у P. aeruginosa и Е. coli. При использовании данного метода вначале получают большое количество инсерционных мутантных клонов и подвергают их тотальной проверке на способность к образованию биопленок в сравнении со штаммом, используемым в качестве исходного для мутагенеза. В работе J.J. Dennis и G.J. Zylstra в качестве мигрирующего генетического элемента был использован пласпозон - плазмида, в состав которой входит транспозон с антибиотико-устойчивой кассетой. Пласпозон способен полностью встраиваться в любое место хромосомы, нарушая последовательность гена и приводя к инсерционной мутации в этом гене. Инсерция пласпозона в геном исходного штамма может привести к нарушению работы как генов, кодирующих транскрипционные регуляторы, так и любых других генов, и как следствие - к усилению или уменьшению способности бактерий к образованию биопленок. С помощью этого метода была показана роль генов cepl-cepR в QS-регуляции у В. cepacia . Другой подход для изучения генов, контролирующих развитие биопленок у P. aeruginosa, был использован А. Finelli с соавт, которые использовали систему исследования генов, экспрессируемых в зрелой биопленке. В основе метода лежит использование мутанта-ауксотрофа со строгой питательной потребностью, позволяющего отбирать активные промоторы в биопленках, способные восстановить прототрофность у мутанта. Для определения факторов, влияющих на трехмерную структуру и, следовательно, на устойчивость биопленки к механическому повреждению, индивидуальные клетки должны быть помечены таким образом, чтобы их можно было визуализировать с применением эпифлюоресценции или КСЛМ. Метод мечения включает помещение последовательности ДНК, которая кодирует флуоресцентную метку, например такую, как зеленый флуоресцентный белок (green fluorescence protein - GFP), в хромосому бактерии с помощью плазмидного вектора. Для флуоресценции GFP не требуется каких-либо кофакторов или субстратов и, следовательно, возможно непосредственное in vivo наблюдение экспрессии GFP в индивидуальных клетках, клеточных популяциях или даже в целых организмах в режиме реального времени. GFP и его аналоги представляют собой исключительно удобные белки-репортеры для анализа экспрессии генов. Известно, что инсерция в хромосому обеспечивает стабильность в поддержании гена gfp, однако, при этом существует риск нарушения нормальной генной экспрессии в области инсерции, так как ген gfp может встроиться в любое место в хромосоме. В этом случае gfp может быть использован как репортерный ген. Столь же эффективным, но менее разрушительным, является метод использования плазмидного экспрессионного вектора, безопасно обеспечивающего клетку геном флуоресцентного белка, который используется в генно-инженерных конструкциях, применяемых для исследования экспрессии генов в живых тканях и микроорганизмах in vivo (например, при идентификации бактериальных генов с помощью метода замены генов - gene replacement). В литературе описано множество подобных GFP экспрессионных векторов, однако только несколько из них применимы для использования в изолятах комплекса В. cepacia. M.D. Levebre и М.А. Valvano описали новые GFP-векторы для исследования регуляции генной экспрессии у В. cenocepacia, но они не были протестированы для использования в биопленках, в которых питательные вещества, pH и кислородный градиент могли отрицательно влиять на экспрессию или фолдинг GFP. С недавних пор для исследований структуры биопленок используют GFP-экспрессионный вектор, содержащий гентамиции-устойчивую кассету для мечения штамма В. cenocepacia HI 11 (5. cepacia геномовар III). Изменения в метаболизме бактерий при их переходе к прикрепленному образу жизни изучались путем сравнительного анализа состава мРНК и белков в клетках планктонных и биопленочных бактерий. Эти исследования наряду с микроскопическими наблюдениями позволили описать различные стадии развития биопленок, в том числе их прикрепление к субстрату, образование микроколоний и каналов, созревание биопленок, а затем и дисперсию клеток. Для выявления степени различий в экспрессии генов и, соответственно, в белковых составах клеток на разных стадиях развития биопленки применяют протеомный анализ. При этом выращенные бактерии после центрифугирования и промывания для удаления среды выращивания подвергают одномерному электрофорезу. Преимущество одномерного фореза состоит в том, что белковый портрет культуры получается более полным, чем при двухмерном, при котором обработка культуры приводит к потере некоторых мембранных фракций. Далее получают протеомные карты посредством двухмерного гель-электрофореза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии, основанной на лазерной десорбции и ионизации макромолекул, опосредованной матриксом и детекторами ионов, которые позволяют определять время их полета. В этом методе импульсное облучение сорбента, с которым связаны анализируемые макромолекулы, приводит к их эффективной фрагментации и десорбции в вакуум благодаря избирательному поглощению сорбентом энергии света. При этом время полета образовавшихся ионов в анализаторе прямо пропорционально их массе. Данный метод позволяет проводить сравнительный анализ белковых профилей различных мутантных штаммов, что дает возможность определить, каково влияние исследуемой мутации на экспрессию других генов и на генетический контроль изучаемого процесса, в котором эти гены участвуют. 2.3 Методы выявления биоплёнок В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование. Принцип действия микроскопа заключается в том, что рефлексируемое изображение, получаемое через объективы в результате преломления по системе зеркал, поступает на детектор, который обрабатывает приходящие лучи, составляя изображение, передаваемое на монитор компьютера. При помощи движения лазерного луча происходит послойное сканирование исследуемого объекта. Изображение, получаемое на мониторе CLSM по отношению к световому микроскопу, имеет зеркальное отображение под углом 90°. Объёмное изображение в LSCM получается при помощи регистрации флуоресценции в фокусе лазерного луча. Излучаемые фотоны фокусируются объективом на небольшом отверстии, которое ослабляет флуоресцентный сигнал от участков, находящихся не в фокусе. Применение конфокальной сканирующей лазерной микроскопии для исследования биопленок радикально изменило восприятие их структурных и функциональных особенностей. Этот метод дал возможность исследовать биопленки in situ без ограничений, с которыми сталкивается электронная микроскопия (технология подготовки образцов приводила к их обезвоживанию и разрушению, хотя и при более низких увеличениях. С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки - не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности. Скорее они могут быть описаны как гетерогенные во времени и в пространстве структуры, однако основная структура сообщества универсальна, с некоторыми незначительными вариациями. Оценить значение ЛСКМ в современных методах изучения биоплёнок можно на примере работы И.В. Чеботарь с соавт. «Современные технологии исследования бактериальных биоплёнок». Объектом исследования был придонный слой бульонной культуры клинического изолята коагулазопозитивного стафилококка. Микроскопическое исследование проводили с помощью лазерного сканирующего (конфокального) микроскопа LSM 510 Meta. Непосредственно в чашке Петри слой стафилококков окрашивали флюорохромными красителями. Полученные изображения реконструировали и анализировали при помощи компьютерной программы ZeissLSM Image Browser. Визуализация биопленки с помощью конфокальной выявила характерную для биопленок трехмерную. Толщина двухсуточной биопленки S. aureus колебалась от 20 до 47 мкм. Отдельная серия микроскопических исследований подвижности биопленочных стафилококков (с аналогичной флюорохромной окраской) была проведена с применением технологии «резонансный сканер» на лазерном сканирующем (конфокальном) микроскопе TCS; изображения были восстановлены при помощи программного обеспечения LAS AF Lite. Микроскопическое наблюдение за живой биопленкой в режиме реального времени позволило обнаружить особый вид хаотического (теплового) движения стафилококков, находящихся в ее составе. Некоторые стафилококки, являясь микроскопическими частицами, совершали хаотические колебания внутри ограниченного объема, соизмеримого с их размерами. При этом стафилококки могли не иметь прямых контактов с соседними клетками. В отличие от классического броуновского движения перемещения стафилококков были ограничены. Это свидетельствовало о том, что стафилококки механически связаны между собой, и являлось косвенным подтверждением существования необходимого атрибута любой биопленки - внеклеточного матрикса, связывающего биопленочные микробы между собой и с подлежащей поверхностью. Для ультраструктурных исследований рельефа биопленки использовали сканирующий электронный микроскоп JSM 6390А. Фиксацию препарата осуществляли при 4оС в два этапа. Вначале проводили предфиксацию (30 мин) образца в 2,5% растворе глутарового альдегида (рН=7,2) с последующим троекратным отмыванием дистиллированной водой. Затем препарат фиксировали (30 мин) 0,5% раствором OsO4 с последующим троекратным отмыванием в дистиллированной воде. После этого препарат криофиксировали в жидком азоте (-196°С) и подвергали низкотемпературной дегидратации (-100°С) в высоком вакууме в течение 24 ч. После лиофилизации препарат монтировали на держатель электронного микроскопа и на его поверхность методом ионного распыления в аргоновой плазме наносили слой платины (10 нм). Сканирующая электронная микроскопия проводилась при увеличении от 1000 до 10000 раз. В пространственном расположении стафилококков прослеживались два уровня организации. Первый уровень связан с тем, что стафилококки формировали кластеры, включающие от 9 до 55 клеток. На более высоком уровне организации стафилококковые кластеры формировали единую надкластерную структуру, состоящую из многих слоев, - биопленку. Массив биопленки пронизан многочисленными каналами, устья которых открывались на внешнюю (исследуемую) поверхность биопленки. Через просветы каналов не видно подложки, на которой сформировалась биопленка. На 100 мкм2 поверхности биопленки открывается в среднем от 4 до 6 устьев каналов. В образовании стенок каналов в районе устьев принимают участие от 9 до 27 стафилококков. Между стафилококками наблюдалось два типа контактов: непосредственное взаимодействие, с помощью которого формируются кластеры, и матрикс-опосредованные связи. Последние обнаруживались при увеличении от 3000 до 15 000: между отдельными стафилококками существовали необычные «перемычки» - структуры биопленочного матрикса, связывающие бактерии друг с другом. Клеточная поверхность большинства стафилококков - ровной округлой формы, исключения составляли участки клеточной поверхности, связанные с внеклеточным матриксом. Эта поверхность была неровной, матрикс представлял собой неструктурированную, неоформленную субстанцию. Следует отметить, что биопленочный матрикс в условиях in vitro может быть образован как активно секретируемыми бактериальными полимерами, так и дериватами клеток, полученными в результате аутолиза. Другие методы основаны на сорбции молекул красителя на структурах биопленки, с последующей их отмывкой (десорбцией) в органические растворители. Такой способ индикации биопленок наиболее часто используется в статических методах культивирования микробных биопленок и позволяет дать условную количественную характеристику образовавшимся микробным сообществам, т. е. чем больше образуется матрикс биопленки, тем больше красителя сорбируется на его поверхности и тем выше оптическая плотность образца. Подобный метод был использован в работе Л. В. Лагун с соавт. «Интенсивность образования микробных биоплёнок микроорганизмами, выделнными при пиелонефритах и мочекаменной болезни» В исследовании использовали суточные культуры микроорганизмов, выращенные на агаре Мюллера-Хинтона. Посевы инкубировали в шейкере-инкубаторе при 37 °С в течение 24 ч, после чего бульонную культуру осторожно удаляли и вносили в пробирки 1 мл 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового для окрашивания сформированных биопленок. Окрашивание проводили при 37 °С в течение 30 мин. Далее, полностью удалив из пробирок раствор кристаллического фиолетового, проводили экстракцию красителя из биопленки в 1 мл 96% этанола в течение 1 часа при комнатной температуре. Измерение биолюминесценции (BPI) - достаточно новый метод изучения и детекции биопленок, который можно использовать как in vitro, так и in vivo. При искусственном введении в бактерии плазмид, ответственных за синтез люминесцирующего белка, можно проводить визуализацию как адгезированных бактерий, так и матрикса биопленки. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также стал сравнительно недавно использоваться для изучения биопленок в медицине (этот метод часто совмещается с методом CLSM). Метод гибридизации применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в клетках, образующих биопленки, что позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в бактериях. С помощью этого метода была определена неоднородность бактерий в биопленке и выявлены клетки-персистеры, ответственные за выживание популяции во время воздействия летальных для основной массы клеток факторов. Приложение 1 Стадии развития биоплёнки  Приложение 2 Сканирующая электронная микроскопия поверхности двухсуточной биопленки, сформированной S. Aureus  1 2 |