Поройский. Экспериментальное, морфологическое и клиническое обоснование патогенеза, диагностики и профилактики послеоперационного спайкообразования 14. 01. 17 хирургия 14. 03. 02 патологическая анатомия
 Скачать 0.72 Mb.
|
|
IX. Обоснование нового направления профилактики послеоперационного спайкообразования. Эксперимент выполнен на 320 крысах, разделенных на 2 группы сравнения (по 160 животных, в каждой из которых в качестве патогенетического средства воздействия на послеоперационную эндотелиальную дисфункцию сосудов брюшины применялись в 1 группе – Сулодексид (Весел Дуэ Ф) – 30 ЕВЛ (единицы высвобождения липопротеинлипазы) (А Wassermann, Италия) и во 2 группе – РГПУ-189 – 50мг/кг (лаборатория фармакологии сердечно-сосудистых средств НИИ фармакологии ВолгГМУ – завлабораторией, чл.-корр. РАМН, проф, д.м.н. И.Н.Тюренков). Способ введения всех перечисленных веществ – per os (зондовое), задней дои в течение недель после оперативного вмешательства. В качестве растворителя использовали 0,9% раствор хлорида натрия. Группой контроля явились животные экспериментальной группы, без введения лекарственных средств, послеоперационная реакция брюшины которых была ранее исследована. Основные направления эксперимента четко соответствовали описанным ранее методикам, примененным для выявления основных механизмов реакции брюшины на операционную травму. Оценивались скорость локального кровотока при модификации синтеза эндогенного оксида азота (II), состояние медиаторной функции эндотелия (III), морфология сформировавшихся послеоперационных спаек (VII). X. Клинико-экспериментальное исследование возможностей диагностики и дифференциальной диагностики послеоперационного спайкообразо- вания с использованием дистанционного тепловидения и его сочетания с ультразвуковым методом. Эксперимент выполненна 30 взрослых беспородных котах весом от 2,5 до 4 кг. Интактным животным выполнялось тепловизионное исследование (контрольная группа. Затем всем животным наносилась стандартная операционная травма (группа сравнения, этапы которой соответствовали ранее представленной модели срединная лапаротомия, идентификация и выведение в рану илеоцекального угла, десерозирование висцеральной брюшины купола слепой кишки, конечного отдела подвздошной кишки и двух аналогичных дефектов париетальной брюшины правого бокового канала размером 1,0 на 0,5 см, ушивание раны 5 отдельными узловыми швами. Динамическое тепловизионное обследование (теплоскопия, те- плография, радиометрия) выполнялись на 10 и 30 сутки после нанесения стандартной операционной травмы на АПК Радуга чувствительностью С с возможностью получения серии изображений в масштабе реального времени. Регистрация и анализ тепловизионных исследований проведено с использованием компьютерной программы разработанной ОКБ Ритм (г.Таганрог). После последнего тепловизионного исследования выполнялась релапаротомия, ревизия органов брюшной полости, идентификация образовавшихся сращений, сопоставление локализации спаек и картины зон гипертермии на термограмме, забор биоптатов сращений для проведения гистологического исследования. Биопсийный материал спаек подготавливался для световой микроскопии по ранее описанной типичной методике, сих последующей окраской гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, Маллори. При морфологическом описании спаек нами использовались ранее предложенные морфологические критерии [Поройский СВ, 2003]: удельные объемы соединительной ткани и ее видов (рыхлой и плотной, жировой ткани, выраженность лимфогистиоцитарной инфильтрации, сосудистого компонента. Клиническое исследование выполнено при плановом тепловизионном обследование 137 человек, разделенных на 3 клинические группы, сформированных по характеру жалоб 1 группа (контрольная) – пациенты без клинических признаков заболеваний (n=43), 2 группа – пациенты с болевым синдромом живота и отсутствием в анамнезе лапаротомных вмешательств (n=31), 3 группа – пациенты с болевым синдромом живота и наличием в анамнезе ранее перенесенных лапаротомных вмешательств (n=63). Давность перенесенных оперативных вмешательств составляла от 1 до 12 лет. Средний возраст пациентов контрольной группы составил 38,8±2,9 года, 2 группы 44,5±3,3 года, 3 группы – 34,9±4,1 года. По половому признаку преобладали женщины 1:5. Обследование всех пациентов проводилось в помещении с постоянной температурой воздуха 21,0°С.±1.0°С, влажность 40-70%, скорость движения воздуха не больше 0,25 мс. Адаптация пациента к окружающей температуре проводилась в течение 20 минут. Обследование пациентов всех групп проводилось в интервале температур от 27 до 37 С, с диапазоном шкалы температур от 5 до 20 С (чаще 10 С. Последовательно измерялась температура в 10 точках передней поверхности области живота, при необходимости дополнительные точки, по 4 точкам в правой и левой боковым поверхностям, 6 точкам задней поверхности, формировались горизонтальные и вертикальные термопрофили, строились гистерограммы. Обследование проводилось в вертикальном и горизонтальном положении пациентов. Проводилась оценка качественных (изучение распределения участков гипо-, изо- и гипертермии) и количественных (определение разности температур между измененным участком и симметричной стороной, в сравнении с окружающими тканями) показателей. В качестве основных характеристик использовались данные о положении, числе, форме, размерах, интенсивности, структуре, контурах, смещении и окружающих тканях участках гипо- или гипертермии в проекции измененных участков. Для увеличения температурного градиента зон гипертермии и повышения специфичности термограмм, во всех ранее описанных группах после выполнения исходной термографии, нами предложен и впервые применен для диагностики послеоперационных сращений тест с глюкозой. Тест включал предварительную дачу больному за 1 час до повторного исследования раствора глюкозы (на 250 мл. воды 75 гр. глюкозы. Повторная термография выполнялась через 30 мини через 1 час после прием раствора глюкозы. Ультразвуковое исследование проводилось на аппарате SSD 660A «Toshiba» (Япония, в В-режиме, 20 режиме энергетического и цветового доплеровского картирования с использованием датчиков 3,5 и 10 МГц с применением функциональных проб (дыхание, натуживание, пальпация, изменение положения тела пациента. В последующем производился анализ полученных результатов, его сопоставление сданными термографии, ориентируясь на выполненную при тепловизионном исследовании маркировку анатомических ориентиров. Вариационно-статистическая обработка полученных результатов проводили общепринятыми методами [Плохинский НА, 1980; Эренберг А, 1981; Автандилов Г.Г. 1990; Браверман Э.М., Мучник Н.Б., 1993; Плато- нов А.Е., 2000]. Расчет средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности, анализ статистической значимости различий проводился с применением критерия Стьюдента, од- нофакторного дисперсионного анализа, критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони; достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни. Обработка данных производилась с помощью пакетов программ, BioStat 2008 5.2.5.0., Microsoft Office EXCEL 2010 (Microsoft, USA) Результаты исследования и их обсуждение Для изучения патогенеза послеоперационного спайкообразования брюшной полости, а также оценки влияния на адгезиогенез новых способов его профилактики, был разработан комплексный морфо-функциональный подход, позволяющий оценить характер функционирования NO системы, выраженность послеоперационной эндотелиальной дисфункции (ЭД) и их связь с морфологическим строением брюшины, организацией перитонеальной жидкости, распространенностью спайкообразования. Данный подход включал последовательное применение лабораторных методик, в динамике адгезиогенеза: 1) исследование послеоперационного функционального состояния эндотелия сосудов брюшины (эндотелий зависимой и эндотелий независимой вазодилатации); 2) исследование послеоперационной медиаторной функции эндотелиоцитов (e-NOS, Endotelin-1, vWF); 3) оценка механизма послеоперационной эндотелиальной дисфункции и ее исходов (апоптотические белки – Caspasa-3, TRAIL) 4) оценка послеоперационной эндотелиальной провоспалительной активности (белок – NF κB), морфологическое исследование динамики периоперационного перитонита 5) исследование системной послеоперационной реакции брюшины (гистологическое и морфометрическое исследование разных по локализации и функции отделов брюшины 6) исследование послеоперационного состояния перитонеальной жидкости клеточные, коллоидно-кристаллоидные взаимоотношения, уровня фибриногена 7) макроскопическая оценка послеоперационных спаек в абсолютных цифрах (уровень спаечного процесса, средний объем спаек, среднее количество спаек 8) микроскопическая оценка послеоперационных спаек. Используя комплексный морфо-функциональный подход, было выявлено, что первичной реакцией брюшин на операционную травму является изменение 21 функционального состояния микроциркуляторной системы. Исследование проведено с использованием разработанной модели стандартной операционной травмы (Патент РФ на изобретение №2374699 от 27.11.2009). Влияние операционной травмы различного объема на скорость локального кровотока брюшины во всех группах имела сходную тенденцию в виде ее снижения к 2 суткам послеоперационного периода, проявляющуюся в виде уменьшения силы и насыщенности спектра ультразвукового сигнала. При этом отмечалась однотипная реакция микроциркуляторного русла на воздействие операционной травмы различного объема в виде снижения скорости брюшинного кровотока. Однако, время восстановления исходных значений скорости локального кровотока брюшины имело четкую связь с объемом операционной травмы Рис. Так, в 1 группе исходное значение скорости локального кровотока достигалось к 4 послеоперационным суткам, во 2 группе – к 6 сутками в группе с максимальным объемом операционной травмы (3 группа) – к 9 суткам. Примечание * – достоверно по отношению к 1 группе животных (P≤0,05) достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Рис. 1. Послеоперационная динамика скорости локального кровотока брюшины при воздействии операционной травмы различного объема Вазодилатирующая функция эндотелия при воздействии операционной травмы различного объема оценивалась с использованием золотого стандарта верификации ЭД с использованием активации и блокады оксида азота с помощью анализаторов эндотелий зависимой вазодилатации: ацетилхолина (АХ, нитро- L- аргинином (н-L-арг), аргинином (L-арг), и анализатором эндотелий независимой вазодилатации – нитроглицерина. Согласно проведенным исследованиям, приведении АХ, в 1, 2, 3 группах отмечалось обратимое снижение стимулированного синтеза, отражающего развитие обратимой ЭД. При этом четко прослеживалась зависимость увеличения объема операционной травмы и выраженности ЭД, длительности периода функциональных нарушений эндотелия в направлении группа < 2 группа < 3 группа (Рис. Период послеоперационной дисфункции эндотелия связанной с аспектом снижения стимулированного синтеза NO коррелировал с сроками 22 восстановления исходных значений гемоциркуляции в послеоперационном периоде в 1 группе – к 4 суткам, в 2 группе – к 6 сутками в 3 группе – к 9 суткам. Примечание * – достоверно по отношению к 1 группе животных (P≤0,05), # – достоверно по отношению к 1 послеоперационным суткам (P≤0,05) (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Рис. Изменение скорости кровотока в послеоперационном периоде на фоне введения ацетилхолина при различном объеме операционной травмы При исследовании эндотелий зависимой вазодилатации, связанной с стимулированием базального уровня NO нитро- аргинином (н-L-арг) было определено обратимое снижение скорости кровотока во всех исследуемых группах. Причиной данного снижения можно считать блокаду е (E- синтазы) и как следствие снижение базального уровня NO, подтверждающие присутствие обратимых функциональных изменений эндотелия в ответ на операционную травму различного объема. Аналогично реакции на АХ прослеживалась зависимость увеличения объема операционной травмы и выраженности ЭД, длительности периода функциональных нарушений эндотелия в направлении группа < 2 группа < 3 группа (Рис. Период послеоперационной дисфункции эндотелия связанной с аспектом снижения базального синтеза NO коррелировал с сроками восстановления исходных значений ге- моциркуляции в послеоперационном периоде в 1 группе – к 4 суткам, в 2 группе – к 6 сутками в 3 группе – к 9 суткам. Примечание * – достоверно по отношению к 1 группе животных (P≤0,05), # – достоверно по отношению к 1 послеоперационным суткам (P≤0,05) (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) 23 Рис. Изменение скорости кровотока в послеоперационном периоде на фоне введения нитро- аргинином (н-L-арг) при различном объеме операционной травмы При исследовании эндотелий зависимой вазодилатации, связанной с введением аргинина (L-арг) было выявлено увеличение прироста скорости кровотока во всех исследуемых группах, характеризуя эффект L-аргининового парадокса. Данная тенденция подтверждает присутствие послеоперационной реакции эндотелиоцитов в виде обратимой ЭД. При этом отмечалась зависимость выраженности функциональных нарушений и длительности периода функциональных нарушений от объема операционной травмы, что согласуется сданными предыдущих фармакологического тестирования функции эндотелия групп (АХ, н-L-арг): группа < 2 группа < 3 группа (Рис. Период послеоперационной дисфункции эндотелия связанный с снижения базального синтеза NO коррелировал с сроками восстановления исходных значений скорости кровотока в послеоперационном периоде в 1 группе – к 4 суткам, в 2 группе – к 7 сутками в 3 группе – к 10 суткам. Примечание *- достоверно по отношению к 1 группе животных (P≤0,05), # – достоверно по отношению к 1 послеоперационным суткам (P≤0,05) (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Рис. Изменение скорости кровотока в послеоперационном периоде на фоне введения аргинином (L-арг) при различном объеме операционной травмы Исследование эндотелий независимой вазодилатации с использованием нит- роглицирина определило степень влияния на происходящие нарушения вазодиля- тирующей функции мышечного компонента сосудистой стенки. Полученные данные свидетельствовали об отсутствии существенных изменений скорости локального кровотока брюшины при введении нитроглицирина в послеоперационном периоде, по сравнению с контрольным значением, во всех экспериментальных группах (Рис. Данный факт свидетельствует о первичности ЭД в происходящих послеоперационных нарушениях гемодинамики брюшины. При изучении уровня фактора vWF в плазме крови были получены данные, подтверждающие развитие ЭД, потенцируемой операционной травмой различного объема с развитием медиаторной недостаточности, обратимым повышением процессов адгезии, обратимым нарушением в коагуляционном гемостазе со сдвигом в протромботическую сторону. Аналогично реакции 24 эндотелия на маркеры эндотелийзависимой вазодилатации (АХ, н-L-арг, L- арг), прослеживалась зависимость между увеличением объема операционной травмы и выраженности ЭД, длительности периода прокоагулянтных и адге- зивных нарушений плазмы в направлении группа < 2 группа < 3 группа Рис. Период послеоперационной дисфункции эндотелия и реологических нарушений плазмы крови в послеоперационном периоде составили в 1 группе суток, в 2 группе – 6 суток ив группе –9 суток. Примечание (P≥0,05) (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Рис. Изменение скорости кровотока в послеоперационном периоде на фоне введения нитроглицирина (НГ) при различном объеме операционной травмы. Примечание * – достоверно по отношению к 1 группе животных (P≤0,05), # – достоверно по отношению к 1 послеоперационным суткам (P≤0,05) (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Рис. Динамика содержания в плазме крови vWF в послеоперационном периоде после нанесения стандартной операционной травмы различного объема. Итогом плазменного (коагуляционного) механизма свертывания крови, отражающим выраженность изменения функции эндотелия, является образование фибрина, при этом основная роль принадлежит плазменным факторам, в том числе фибриногену. Учитывая, что наиболее выраженное повышение активности vWF во всех группах происходит к 3 суткам, была проведена оценка уровня фибриногена крови именно в этот временной период, выявившая его увеличение во всех группах в направлении 1 группа < 2 группа < 3 группа (Таб.6). Таблица 6 Содержание фибриногена в крови у животных на 3 послеоперационные сутки 1 группа 2 группа 3 группа Контроль 1,81±0,09 1,75±0,07 1,7±0,08 3 сутки 2,1±0,15 2,5±0,17* 2,94±0,17* 25 Примечание *- р, по отношению к контролю (достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Учитывая ранее полученные данные, доказывающие развитие операци- онно опосредованной ЭД сосудов брюшины, был проведен анализ экспрессии е и эндотелина-1, определяющих механизм ЭД. Иммуногистохимиче- ское исследование эндотелиальных клеток сосудистого русла брюшины к моноклональному антигену е, выявило позитивную реакцию материала с тенденцией к обратимому снижению экспрессии в период, соответствующий установленному ранее периоду проявлений признаков обратимой ЭД. Последующее восстановление экспрессии было выявлено в период, сопоставимый с регрессом признаков ЭД в 3 экспериментальной группе – к 8-9 суткам послеоперационного периода (Таб.7). Определение экспрессии к моно- клональному антигену эндотелин-1 выявило антагонистическую направленность характера экспрессии маркера вазоконстрикции (Таб.7). Таблица 7 Динамика иммуногистохимической реакции эндотелиоцитов на маркеры эндотелий зависимой вазодилатации / вазоконстрикции в 3 группе Маркеры ЭЗВК и ЭЗВД Сутки послеоперационного периода К 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 е ИЭ +++ ++ + + + + + ++ ++ ++++++ ОО П 86,3± 3,2 53,7± 2,5** 34,4± 2,7** 33,6± 2,4** 35,4± 2,6** 35,7± 2,9** 34,8± 2,5** 53,7± 2,5** 54,2± 2,7** 84,8± 3,2 85,6± 3,4 Эндоте- лин-1 ИЭ + ОП 34,4± 2,7 47,4± 2,5** 84,8± 3,2** 85,6± 3,4** 85,6± 3,4** 84,8± 3,2** 53,7± 2,5** 54,2± 2,7** 43,7± 2,5** 35,4± 2,6 35,7± 2,9 Примечание ОП – оптическая плотность ИЭ – интенсивность экспрессии ЭЗВК – эндотелий независимая вазоконстрикция; ЭЗВД – эндотелий зависимая вазодилатация. К – контроль, * – (P≤0,05); ** – (P≤0,01) – достоверно по отношению к 1 послеоперационным суткам (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни) Оценка динамики экспрессии апоптотических факторов Caspasa-3, TRAIL, NF-κB и индекса апоптоза (ИА) эндотелиоцитов свидетельствовала о связи послеоперационной ЭД с активацией апаптотических протеинов эндо- телиоцитов. При этом исходный резерв эндотелиальной клетки определяет 1) возможность обратимой компенсации ее состояния с постепенным восстановлением активности е, 2) завершение процесса апоптоза и гибелью эндотелиоцита (Таб.8). Увеличение активности фактора NF-κB и его более длительная экспрессия, по сравнению с другими апоптотическими факторами (Caspasa 3; TRAIL) (Таб.8), на фоне ЭД, позволило сделать заключение о возможной первичности и пусковой роли эндотелиальных нарушений в проявлениях послеоперационной асептической воспалительной реакции брюшины (периоперационного перитонита. При этом, провоспалительная функция реализуется посредством активации фактором NF-κB генов медиаторов воспаления антагониста рецепторов IL-1; IL-2 рецептора α; TNF- |