Поройский. Экспериментальное, морфологическое и клиническое обоснование патогенеза, диагностики и профилактики послеоперационного спайкообразования 14. 01. 17 хирургия 14. 03. 02 патологическая анатомия
 Скачать 0.72 Mb.
|
|
Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы с указанием объекта и методов исследования, 10 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, указателя используемой литературы. Текст диссертации изложен на 380 страницах машинописного (компьютерного) текста, иллюстрирован таблицами, 166 рисунками. Указатель литературы содержит 410 источников, из них 226 на русском языке и 184 на иностранных языках. Материал и методы исследования Экспериментальные исследования проведены в лаборатории моделирования патологии, лаборатории морфологии и иммуногистохимии ГБУ Волгоградский медицинский научный центр, кафедре оперативной хирургии и топографической анатомии ВолгГМУ, лаборатории сердечно-сосудистых средств НИИ фармакологии ВолгГМУ. Клинические исследование реализованы совместно с кафедрой лучевой диагностики и кафедрой акушерства и гинекологии ВолгГМУ. Разработка и внедрение новых компьютерных программ анализа лабораторных данных проведено совместно с кафедрой автоматизированных систем обработки информации и управления Камышинского технологического института (филиал ВолгГТУ) и ООО Адаптивные системы. Для выполнения поставленных задач проведено комплексное экспериментальное и клиническое исследования. Клиническая часть работы осуществлена при лечении и обследовании 297 пациентов. В экспериментах использовано половозрелых самок крыс линии Вистар, весом гр, достигших половозрелого возраста (3 меси беспородных котов. Животные содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а 12 также правил лабораторной практики при проведении исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. Об утверждении правил лабораторной практики (GLP). Весь комплекс экспериментальных исследований был одобрен и регламентирован региональным независимым этическим комитетом, соответствуя основным принципам. Дизайн выполненного клинико-экспериментально исследования включал 10 разделов. I. Экспериментальная модель операционной травмы Для реализации стандартных условий выполнения эксперимента и воспроизведения условий операционного стресса, обусловленного операционной травмой различного объема, была разработана, применена в эксперименте и запатентована новая экспериментальная модель Способ экспериментального моделирования спа- ечного процесса на фоне недостаточности половых гормонов (Патент РФ на изобретение №2374699 от 27.11.2009). Согласно данной модели животные были разделены на 3 равные по количеству группы, учитывающие стандартные технические приемы и отражающие нарастающий объем операционной травмы 1 группу – животные со стандартной операционной травмой, во 2 группе – животным наносилась стандартная операционная травма, дополненная ампутацией матки без удаления яичников ив группе – стандартная операционная травма сопровождалась ампутацией матки с яичниками. При этом стандартная операционная травма включала ряд последовательных этапов. В стерильных условиях, под наркозом (внутрибрюшинное введение раствора этаминала – 40 мг/кг), после обработки операционного поля раствором йодоната и спирта 90%, выполнялась нижнесрединная лапаротомия длиной 2 см. В брюшной полости идентифицировался и выводился в рану илеоцекальный угол. На куполе слепой кишки и дистальном отделе подвздошной кишки десеро- зировались участки висцеральной брюшины размером 0.5×0.5 см, не затрагивая мышечного слоя. Аналогичных размеров дефект париетальной брюшины наносился в области правого бокового канала, вместе перехода брюшины в ее тазовую часть. После выполнения основных этапов методики выполнялся тщательный гемостаз и послойное ушивание лапаротомной раны пятью стерильными нерассасывающимися капроновыми лигатурами. II. Исследование послеоперационного функционального состояния эндоте- лиоцитов – скорости локального кровотока при модификации синтеза эндогенного оксида азота Используя разработанную экспериментальную модель, проведено исследование влияние операционной травмы различного объема на скорость локального кровотока брюшины. Исследование реализовано на наркотизированных крысах (небутал – 40 мг/кг), разделенных на 3 равные группы (по 100 животных, согласно ранее представленному объему операционной травмы. Исследование скорости локального кровотока брюшины, проведено на брыжеечных сосудах. Его регистрация осуществлялась с помощью ультразвукового допплерографа «Минимакс-Доплер», датчика УЗОП-010-01 с рабочей частотой МГц и рабочей компьютерной программы ММ-Д-К- Minimax Doppler v.1.7. (Санкт-Петербург, Россия, использующего математическую обработку сигнала быстрого преобразования Фурье (БПФ) для преобразования цветового спектра распределения кровотока. Оценка скорости локального кровотока осуществлялась сразу после нанесения операционной травмы (1 сутки, а затем ежедневно в течении 10 дней послеоперационного периода. Для оценки функционального состояния эндотелия сосудов брюшины осуществлялась модификация синтеза эндогенного оксида азота при введении ацетилхолина (стимулятор синтеза эндогенного NO) – 0,01 мг/кг, нитро-L–аргинина (блокатора Е-синатзы) в дозе 10 мг/кг, L – аргинина – 300 мг/кг (эндотелий зависимого донатора NO) и нитроглицерина (эндотелий независимого донатора NO) – 15 мг/кг (Тюренков И.Н., Воронков А.В., 2008). При оценке эндотелиальной функции использовалось понятие «L-аргининового парадокса, основанного на свойстве аргинина к увеличению продукции NO на фоне эндотелиальной дисфункции, и отсутствием данной реакции в норме. После выполнения исследований животные выводились из эксперимента путем мгновенной декапитации, выполняемой до их выхода из наркоза. III. Исследование механизма послеоперационной клеточной регуляции и состояния медиаторной функции эндотелия сосудов брюшины. Проведено исследование с использованием иммуногистохимического метода, а также определения фактора Виллебранда крови в группе с наибольшим объемом операционной травмы (стандартная операционная травма дополненная ампутацией матки с придатками группа, данные которого интерпретированы на группы с меньшим объемом операционной травмы (1 и 2 группы. В исследовании использованы 30 крыс. Забор аутопсийного материала (висцеральная брюшина брыжейки тонкой кишки) осуществлялся после мгновенной декапитации, ежедневно на протяжении 10 суток. Группу контроля ставили 5 интактных крыс. Для световой микроскопии полученный вовремя аутопсии материал фиксировался в 10% растворе формалина, обезвоживался, заливался в парафиновые блоки. C помощью роторного микротома приготовлялись парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм, которые после депарафинизации в батарее спиртов восходящей концентрации окрашивались. В исследовании применено иммуногистохимическое окрашивание маркерами эндотелий зависимой вазодилатации – моноклональные антитела к эндотелиальной NOS (Nitric Oxid Synthase, Clone RN5, NCL-NOS-3 F P (HIER)), эндотелий зависимой вазокон- стрикции – моноклональные антитела к эндотелину-1 (Endothelin-1 Receptor (ETA), Clone RJT 24, NCL-L-ETA P (HIER)); апоптоза – моноклональные антитела к кас- пазе (Clone JHM62, Novocastra), к лиганду зависимого апоптоза – TRAIL (Clone 27B12, Novocastra), к транскрипционному фактору NF-kB (NF-kappa B p65, BioGenex). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазно- го метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Индекс апопотоза рассчитывали как отношение эндотелиальных клеток с имуногистохи- мическими признаками апопотоза к нормальным эндотелиоцитам (%). Для достоверности полученных результатов применяли позитивные контроли антигенов лимфатические узлы, печень при недифференцированном лейкозе, негативные контроли антигенов (предстательная железа, головной мозги негативные контро- 14 ли антител (обработка срезов без нанесения первичных антител. Оценка результатов иммуногистохимического исследования осуществлялась с использованием полуколичественной оценочной шкалы («0» – негативное окрашивание, «+» – слабое окрашивание, «++» – умеренное окрашивание, «+++» – выраженное окрашивание) и количественной характеристики – оптическая плотность, рассчитываемая с помощью программы морфометрического анализа изображений ВидеоТест- Морфо 4.0 (Россия. Исследование проведено под бинокулярным микроскопом Nikon «Eclipse E200» с использованием объективах, хи окулярах. Микрофотосъемка выполнялась адаптированной к микроскопу цифровой фотокамерой Canon Power Shot A640 с использованием программного обеспечения Т. Определение фактора Виллебранда (vWF) проводилось на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "Биола" (наборы “Ренам” для определения фактора Вллебранда). IV. Морфологическая характеристика послеоперационной реакции участков брюшины различной локализации и функции Исследование проведено на 90 крысах, равнозначно распределенных по 3 группам (по 30 животных, соответственно объему операционной травмы, согласно ранее описанной экспериментальной модели. В качестве исследуемого аутопсийного материала нами осуществлялся забор участков брюшины париетальная брюшина нижней трети правого бокового канала (тазовый отдел, париетальная брюшина диафрагмы и висцеральная брюшина тонкого кишечника. Забор аутопсийного материала производился сразу после операции (1 сут, на 3, 5, 7 и 10 сутки послеоперационного периода. Приготовление гистологических препаратов производилась повыше изложенной типовой методике, включающей дегидратацию, заливку в парафиновые блоки, депарафинизацию, нарезку блоков в микротоме. В качестве обзорной окраски срезов применялся гематоксилин и эозин. Для дифференцировки тканевых составляющих отдельные препараты окрашивали трехцветным методом по Маллори. С помощью компьютерной программы «Видеотест Морфо 3.0» (СПб, Россия) проводились измерения новых морфометрических критериев, определенных нами как значимые толщины брюшины (мкм, в х различных её участках, численная плотность мезотелиоцитов (мкм длины среза, средний диаметр ядер мезотелиоцитов мкм, показатель формы поверхности. Показатель формы, как безразмерную величину, рассчитывали как отношение реальной длины границы ткани на участке ткани к длине отрезка между его границами (100 мкм. V. Исследование послеоперационного состояния резорбционной функции брюшины. Для исследования влияния операционной травмы различного объема на резорбционную функцию брюшины, была предложена, апробирована, запатентована и применена в эксперименте новая экспериментальная модель (Способ экспериментальной оценки резорбционной функции брюшины – патент РФ на изобретение от 27.09.2010). Эксперимент проведен на 90 крысах, разделенных случайным образом на 3 группы (по 30 животных, согласно ранее описанной модели операционной травмы различного объема. Резорбционная функция брюшины оценивалась опосредованно, путем измерения временного промежутка, необходимого для вхождения животного в стадию хирургического сна после внутри- брюшинного введения раствора этаминала натрия. Критерием хирургической стадии наркоза явилось отсутствие активных движений, реакции на внешние раздражители, роговичного и мигательного рефлексов, дыхательной аритмии. Для оценки исходного (физиологического) уровня резорбции брюшины у интактных животных ежедневно в течение 4 дней внутрибрюшинно вводилась стандартная доза раствора этаминала, рассчитанная индивидуально для каждого (40 мг/кг). На 4 сутки измерения физиологической резорбции, после вхождения животных в хирургическую стадию наркоза и измерения временных промежутков, всем животным проводилось операционное вмешательство согласно приведенным группам. Последующее внутрибрюшинное введение этаминала и измерение временных промежутков, отражающих резорбционную функцию брюшины на фоне операционного вмешательства, осуществлялось ежедневно на протяжении 10 суток. VI. Исследование послеоперационной динамики состава перитонеальной жидкости. Эксперимент выполнен на 90 крысах, разделенных случайным образом на 3 группы (по 30 животных, согласно ранее описанной модели операционной травмы различного объема. В экспериментальных группах через день (1 день соответствует выполнению операции) в течение 30 дней послеоперационного периода производился забор перитонеальной жидкости с последующим ее цитологическим, электрофоретическим исследованием и анализом методом клиновидной дегидратации (кристаллографии. Группу контроля ставили 5 интактных крысу которых аналогичные заборы выполнялись в течение 5 дней до нанесения операционной травмы. Для забора пе- ритонеальной жидкости использовались разработанные и запатентованные устройства (Патент РФ на полезную модель Устройство для фиксации экспериментального животного при заборе перитонеальной жидкости №72405 от 20.04.2008) и Устройство для пункции брюшной полости при заборе пе- ритонеальной жидкости у экспериментального животного №89954 от 2.12.2009). Послеоперационная динамика фибриногена исследовалась электрофоретическим методом на агарозном геле с использованием диагностического набора С GEL PROTEIN 100» (Польша, источника питания и электрофоретической камеры «Helena biosciences helios Europe» по стандартной методике, описанной производителями. Анализ данных выполнялся с использованием стандартной компьютерной программы «BioTest». Материал для цитологического исследования центрифугировался, надосадочную жидкость удаляли, из полученной взвеси делали мазки. Мазки окрашивались методом Романовского – Гимзе, подвергали цитологическому анализу с использованием световой микроскопии с оценкой результата из расчета на 100 клеток. Для оптимизации процесса анализа цитограмм применена система автоматизированного компьютерного цитологического анализа (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ №2008612911 от 16.06.2008). Для кристаллографического исследования полученную при пункции брюшной полости смесь перитонеальной жидкости и физиологического раствора наносили в форме капли на поверхность предметного стекла и высушивали на открытой поверхности при температуре С. Наличие стекловидного кольца по периферии высушенной капли характеризовало пригодность приготовленной смеси для поляризационно-оптического исследования, проводимого через 48 – 72 часа. Определяли наличие типичных атипичных анизотропных текстур, типы структур, их динамику, определяющих соотношение колллоидно-кристаллоидных компонентов перитоне- альной жидкости [В.Н.Шабалиным, С.Н.Шатохиной (2001)]. Для оптимизации процедуры анализа фаций была разработана, применена в эксперименте и запатентована программа для исследования медико-биологического препарата, полученного методом клиновидной дегидратации (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ №2009616949 от 15.12.2009). VII. Морфологическое исследование сформировавшихся послеоперационных спаек. Эксперимент выполнен на 90 крысах, разделенных случайным образом на 3 группы (по 30 животных, согласно ранее описанной модели операционной травмы различного объема. На 30 сутки послеоперационного периода (период адгезиогенеза), под этаминаловым наркозом производилась ревизия брюшной полости и определялась макроскопическая харкатеристика спаек морфологический тип, уровень спаечного процесса (УСП) и ряд новых критериев средний объем спайки (СОС) и среднее количество спаек (СКС). Все обнаруженные сращения морфотипировались на типы тяжевые, нитевидные, паутинные, пленчатые, плоскостные. Для количественной оценки спаечного процесса применена ранее разработанная математическая формула (патент на изобретение № 2202279, от 20.04.2003): V спаек (УСП) = l тяж. (d тяж / 2) 2 + l нитч. (d нитч. / 2) 2 + l паут. (d паут. / 2) 2 + S пленч. h пленч. + S плоск. h плоск. где, V – объем, l – длина спайки, d – диаметр поперечного сечения спайки, S – площадь спайки, h – толщина спайки, = 3,14., и новые математические формулы V спайки (СОС) = (V спаек М) / N спаек , СКС = N спаек / М, где V спаек – уровень спаечного процесса (см М – суммарное количество опытных животных, участвующих в эксперименте N спаек – суммарное количество спаек, обнаруженных у животных экспериментальной группы. Для гистологической характеристики осуществлялся забор биопсийного материала спаек. После забора материала животные выводились из эксперимента путем мгновенной декапитации, выполняемой до их выхода из наркоза. Аутопсийный материал ткани спаек подготавливался для световой микроскопии по ранее описанной типичной методике, сих окраской гематоксилином и эозином. Используя предложенные критерии [Поройский СВ, 2003], проведен морфостереометриче- ский анализ с определением удельных объемов [Автандилов Г.Г.,1981]: 1) соединительной ткани 2) жировой ткани 3) рыхлой соединительной ткани 4) плотной соединительной ткани. В спайках полуколичественно определялась выраженность мезотелизации («0» – нет, «+» – единичные мезотелиальные участки, «++» – до ½ поверхности -, «+++» – более ½ поверхности, лимфогистиоцитарной инфильтрации нет, «+» – единичные очаговые изменения, «++» – распространенные очаговые изменения, «+++» – диффузные изменения, сосудистого компонента («0» – нет, «+» – 1-5 в поле зрения, «++» – 5-10 в поле зрения, «+++» – >10 в поле зрения. Исследование проведено под бинокулярным микроскопом Nikon «Eclipse E200» с использованием объективах, хи окулярах. Микрофотосъемка выполнялась адаптированной к микроскопу цифровой фотокамерой Canon Power Shot A640 с использованием программного обеспечения Т. VIII. Клиническое исследование распространенности послеоперационного спайкообразования и содержания в крови половых гормонов у оперированных женщин.Открытое простое проспективное исследование выполнено на базе отделения гинекологии ГКЗ «ВОКБ №1». В исследовании участвовало160женщин, разделенных на 2 равные группы, учитывая принцип объема выполненного оперативного вмешательства 1 группа (n=80) – пациентки, перенесшие лапаротомию, гистерэктомию с придатками и 2 группа (n=80) – пациентки, перенесшие лапаротомию, гистерэктомию без придатков. Критериями включения пациенток в исследования явились показания к выполнению гистерэктомии по поводу невоспали- тельных заболеваний, сохраненная менструальная функция. Из группы исследования исключались пациентки, находящиеся в менопаузе, имеющие клинически или интароперационно верифицированные признаки спаечного процесса, операции на органах брюшной полости, воспалительная этиология заболевания (тубоовариаль- ные образования) и наличие специфических инфекций в анамнезе, признаки гормональной недостаточности (эндокринное бесплодие, синдром преждевременного истощения яичников. В 1 группе преобладали пациентки перименопаузального возраста (72,5%), во 2 группе – позднего репродуктивного возраста (50%). На момент операции средний возраст в 1 группе составил – 47,4±3,4 года, во 2 группе 43,5±5,2 года. Все женщины имели сохраненную менструальную функцию (100%), сопровождающуюся изменениями, чаще в виде гиперполименорреи (1 группа – 86,3%, 2 группа – 90%) и альгоменорреи (1 группа – 47,5%, 2 группа – 40%). Среди ранее перенесенных гинекологических заболеваний наиболее часто встречались хронические неспецифические воспалительные заболевания гениталий (вагинит, сальпингоофорит, эндометрит. Показаниями к оперативному лечению в большинстве случаев явились миома матки и аденомиоз (1 группа – 86,3%, 2 группа – 87,5%). В 76,9% применялся субтотальный вариант гистерэктомии. Ведение послеоперационного периода осуществлялось согласно установленным МЗ РФ стандартам оказания медицинской помощи. Пациентки выписывались без осложнений на 8-10 сутки после операции. Оценка и анализ распространенности спаечного процесса проводилась исходя изданных послеоперационного обследования 1) осмотри бимануальное исследование (при повторном обращении на 38-55 сутки после операции) – оценка подвижности культи, пальпация уплотнений, определение болезненности 2) ультразвуковое исследование (через 30-60 дней после операции) – проводилось вагинальным датчиком аппаратов экспертного класса Siemens «Antares», Voluson 730. Лабораторно определялись 1) уровень фибриногена плазмы (1-3 послеоперационные сутки) – забор крови натощак, определение методом |