Фармакогностическое исследование, контроль качества и стандартизация травы звездчатки средней 14. 04. 02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия
 Скачать 0.71 Mb.
|
|
На правах рукописи Наумов Андрей Вячеславович ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ, КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ ЗВЕЗДЧАТКИ СРЕДНЕЙ 14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2018 2 Диссертационная работа выполнена вфедеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор – Попов Дмитрий Матвеевич Официальные оппоненты: Патудин Александр Васильевич - доктор фармацевтических наук, профессор, Российское гомеопатичекое общество, вице-президент Копытько Янина Фёдоровна - кандидат фармацевтических наук, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений», отдел стандартизации и сертификации, ведущий научный сотрудник Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится «___» ______ 2018 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНМБ ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) по адресу: 119034, г. Москва, Зубовский бульвар, д. 37/1 и на сайте организации: https://www.sechenov.ru Автореферат разослан «____» _____________ 2017 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор Демина Наталья Борисовна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Перед современной фармацевтической наукой стоит задача разработки новых лекарственных средств и совершенствования существующих. Они должны обладать высокой фармакологической активностью, малой токсичностью и финансовой доступностью для широкого круга населения. Разрабатываются новые препараты в виде аллопатических и гомеопатических лекарственных средств, и в виде биологически активных добавок. Химическая природа биологически активных веществ растений близка человеческому организму, и они легко включаются в биохимические процессы организма человека, оказывают многостороннее, мягкое, регулирующее и безопасное действие при длительном применении. Расширение сырьевой базы, а, следовательно, и арсенала лекарственных средств из растительного лекарственного сырья, повышение требований к их качеству требует нового подхода к их анализу и стандартизации. Трава звездчатки средней (Stellaria media L.) издавна используется в народной медицине в качестве противовоспалительного, гипотензивного, коронарорасширяющего, желчегонного, кровоостанавливающего, молокогонного, обезболивающего и мочегонного средства. Звездчатка средняя включена в перечень простых (однокомпонентных) гомеопатических лекарственных средств, разрешенных к применению в России, в соответствии с приказом Минздравмедпрома России № 335 от 29.11.1995 г. (Приложение 2), а также в гомеопатическую фармакопею США. Звездчатка входит в состав комплексного гомеопатического препарата компании «Heel» «Rhododendroneel S», который используется для лечения невралгии, ревматизма мягких тканей и артритических нарушений. В России лекарственные препараты из звездчатки средней и нормативная документация на них отсутствуют, но в аптеках имеется БАД «Высушенная трава звездчатки»( компания "Хорст", компания «Русские корни»). Поэтому изучение химического состава травы звездчатки средней, разработка методик 4 качественного и количественного определения основных действующих веществ, разработка нормативной документации является актуальной задачей. Степень разработанности темы исследования Несмотря на то, что проведены исследования различных видов звездчатки (Я.В. Горина, Е.Ю. Анчеева), химический состав звездчатки средней изучен недостаточно. Авторами не были выявлены и не определены некоторые классы соединений. Например, сапонины. Не была исследована свежая трава звездчатки средней. Свежее сырье широко используется в гомеопатической практике и входит в состав фитопрепаратов. Отечественные нормативные документы на сырьё и настойки гомеопатические матричные не разработаны в связи с отсутствием достаточных данных о подробном составе БАВ сырья какого? и методах их анализа. Не установлен количественный состав БАВ, особенно свежего сырья. Цель исследования - является углубленное фармакогностическое исследование травы звездчатки средней для создания современной нормативной документации на сырье - получение гомеопатических лекарственных препаратов. Для осуществления поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1. Изучить литературу и нормативную документацию по траве звездчатки средней; 2. Выявить значимые морфолого-анатомические диагностические признаки травы звездчатки средней; 3. Используя современные физико – химические методы анализа изучить состав флавоноидов в траве звездчатки средней; Изучить распределение флавоноидов по органам звездчатки средней и установить динамику их накопления по фазам вегетации растения; 4.Изучить качественный состав и дать количественную оценку содержанию сапонинов звездчатки средней. Разработать методику количественного определения сапонинов в сырье; 5 5. Изучить качественный состав и дать количественную оценку углеводов, амионокислот, витаминов звездчатки средней; 6. Получить и охарактеризовать настойки гомеопатические матричные и первые два десятичных разведения из свежей и высушенной травы звездчатки средней; 7. Разработать методики стандартизации настоек гомеопатических матричных из травы звездчатки средней; 8. Разработать проекты НД на свежую и высушенную траву и настойки гомеопатические матричные из свежей и высушенной травы звездчатки средней. Научная новизна исследования На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностически значимые признаки сырья – травы звездчатки средней для установления подлинности. Подобраны оптимальные условия качественного и количественного анализа биологически активных веществ-и разработаны физико-химические методики контроля. Впервые в траве звездчатки средней с помощью метода ВЭЖХ/МС обнаружены три новых флавоноидных соединения. Спектрофотометрическим методом определено количественное содержание суммы флавоноидов в пересчёте на лютеолин-7-гликозид в сырье звездчатки средней и препаратах звездчатки средней. Установлено количественное содержание флавоноидов в различных частях растения (цветки с семенами, листья, стебли, корни). Определен оптимальный срок заготовки сырья в зависимости от стадии вегетации. Впервые изучен гомеопатические препараты: настойка гомеопатическая матричная из свежего сырья и настойка гомеопатическая матричная из высушенного сырья. Разработаны методы стандартизации сырья и препаратов. Теоретическая и практическая значимость результатов исследования Результаты проведенных исследований позволяют расширить представления о химическом составе, морфолого-анатомических признаках и 6 фармакологической активности свежего и высушенного сырья звездчатки средней. На основе проведенных исследований разработаны проекты НД: «Звездчатки средней трава свежая Stellariae mediae herba recens», «Настойка гомеопатическая матричная Stellaria media», «Звездчатки средней трава Stellariae mediae herba», «Настойка гомеопатическая матричная Stellaria media». Кавычки удалить «Звездчатки средней трава высушенная» для включения в ГФ ХIII. Проекты НД переданы в Центр фармакопеи и международного сотрудничества. Основные положения, выносимые на защиту: Результаты изучения качественного состава и количественного содержания БАВ (сапонинов, флавоноидов, витаминов, аминокислот, углеводов) для стандартизации растительного сырья звездчатки средней. Результаты разработки методик изготовления гомеопатических матричных настоек из свежего и высушенного сырья. Результаты стандартизации НГМ из свежего и высушенного сырья. Методология и методы исследования Методология фармакогностического исследования включает научно обоснованную и целесообразно организованную последовательность действий, включающую информационно-исследовательский, фитохимический, стандартизационный, морфолого-анатомический блоки. В процессе выполнения диссертационной работы при проведении фармакогностического исследования использованы химические, физико-химические, макроскопический, микроскопический и статистический методы анализа. Статическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с ГФ XIII. Микробиологический анализ сырья проводили в соответствии с техникой и требованиями, описанными в ГФ XIII. 7 Достоверность научных положений и выводов Достоверность полученных результатов подтверждена проведением большого объема экспериментальных исследований и применением современных методов исследования, позволяющих получать воспроизводимые и достоверные результаты. Полученные результаты исследований статистически обработаны в соответствии с требованиями ГФ XIII. Апробация результатов исследования Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции «Молодых ученых» в НИИ фармации, (Москва, ноябрь 2012 г); на научно – практических конференциях «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (Москва, 2013, 2014, 2015); на Всероссийском научном симпозиуме «Медицинская антропология в России и за её пределами» (Москва, 03.07.2013); на 25 и 27 Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (Москва, 2015). Апробация диссертации состоялась на конференции НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Москва, 2015). Личный вклад автора При непосредственном участии автора определены цели и задачи работы; проведён сбор, обобщение и анализ литературных данных. Диссертант принимал непосредственное участие в разработке методик идентификации и количественного содержания основных БАВ в сырье и настойке звездчатки средней. Диссертантом изготовлены настойки гомеопатические матричные из свежей и высушенной травы звездчатки средней и определены показатели качества разработанной настойки. Автору принадлежит ведущая роль при проведении экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных данных, написании публикаций и нормативной документации. Диссертация и автореферат написаны лично автором. Внедрение результатов исследования Разработанные методы приготовления и стандартизации гомеопатических настоек могут быть 8 внедрены на фармпредприятиях. Материалы исследования могут быть использованы в учебном процессе фармацевтических вузов. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научное положение диссертации соответствует формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия, конкретно пунктам 3, 6 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия. Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова: «Развитие научных и научно – методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств» № 012012616553. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти экспериментальных глав, списка литературы, приложений. Библиографический указатель содержит 155 наименований (38 из которых – иностранные). Приведено 27 таблиц и 27 рисунков. Публикации По теме диссертации опубликовано 9 научных статей, полностью отражающих содержание диссертации; из них 3 статьи в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объектами исследования служили образцы свежей и высушенной травы звездчатки средней (Stellaria media L), сем. гвоздичные (Сaryophyllaceae), собранные в разные стадии вегетации растения, в Тамбовской, Московской, Пермской, Рязанской, Кировской областях. В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей норативной документации. Микроскопический анализ проводили в соответствии с ОФС «техника микроскопического и микрохимического исследования ЛРС»(ГФII). Для исследования готовили микропрепараты из свежего сырья. Готовые 9 микропрепараты изучали под микроскопом МФИ – 3. Результаты документировали с помощью фотоаппарата «Зенит» с микронасадкой МФН – 12. Получение гомеопатических настоек из высушенной и свежей травы звездчатки проводилось в соответствии ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные». Определение числовых показателей матричных настоек (плотность, сухой остаток, микробиологическая чистота) проводили в соответствии с ГФ XI, ГФ XII часть 1. Для стандартизации сырья и НГМ проведена разработка соответствующих методик идентификации и количественного определения активных компонентов на основе анализа данных литературы и нормативной документации. Идентификацию БАВ проводили качественными реакциями и методом ТСХ на пластинках «Sorbifil» (Россия) в различных системах растворителя. Кроме того качественное определение БАВ проводили методом ВЭЖХ. Очищенный испытуемый раствор и раствор модельной смеси стандартов хроматографировали на жидкостном хроматографе высокого давления, укомплектованном системой градиентной подачи элюента, УФ - диодноматричным детектором, а также компьютерной системой сборки и обработки данных в следующих условиях: - колонка 250 на 4,6 мм; сорбент Сromosil 100-5C 18 с размером частиц 5 мкм; - температура термостата 38 0 С; - длина волны детектирования 255 нм; - подвижная фаза: ацетонитрил (А), 0,1 % раствор фосфорной кислоты (В); - режим градиентный элюирования. Качественный состав флавоноидных соединений проводили методом ультраэффективной жидкостной хроматографии/масспектрометрии на хроматографе Waters Acquility с тандемным квадрупольным МС-детектором TQD (Waters). Подвижная фаза А (ПФ А). Смесь вода - ацетонитрил (95:5) с муравьиной кислотой. Подвижная фаза В (ПФ В). Ацетонитрил с муравьиной кислотой. Хроматографируют испытуемый раствор 2, приготовленный как 10 указано выше, в следующих условиях: объем пробы 1 мкл; - колонка 0,21 х 5,0 см Acuility UPLC BEH C18 (1,7 мкм); температура колонки 35 0 С; скорость потока 0,5 мл/мин; градиентный режим элюирования; МС детекция в режиме позитивных ионов; параметры детектора: напряжение на капилляре – 3 кВ; напряжение на конусе – 55 В; температура капилляра 450 0 С; температура источника 120 0 С; скорость потока осушающего газа 800 л/ч; скорость потока газа в конусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1000 ед. Для количественного определения флавоноидов нами применен спектрофотометрический метод после проведения реакции комплексообразования с хлоридом алюминия. В качестве стандартного вещества выбран лютеолин-7-гликозид, дифференциальный спектр поглощения которого с алюминия хлоридом в предлагаемых условиях совпадает с дифференциальным спектром поглощения флавоноидов звездчатки средней. Качественный состав и количественное содержание углеводов изучали методом ВЭЖХ. Свободные сахара - способом прямофазной ВЭЖХ на колонке Luna NH 2 4,6 х 250 mm (5 mm) или аналогичной с подвижной фазой: ацетонитрил – вода (70:30) при скорости потока 1 мл/мин, при комнатной температуре с рефрактометрической детекцией. Связанные сахара - способом капиллярного электрофореза. Аминокислотный анализ водорастворимых фракций проводили на аминокислотном анализаторе фирмы «Хитачи» модель 835 на стальной колонке (0,4 х 15 см), заполненной катионообменной смолой марки 2619 (Hitachi Custom lon-Exchange Resin). Количественное определение сапонинов проводили спектрофотометрическим методом, в основе которого лежит способность сапонинов давать окрашивание с кислотой серной концентрированной. При снятии спектров поглощения продуктов реакции стандарта эсцина и извлечения из травы звездчатки средней с кислотой серной концентрированной на регистрирующем спектрофотометре Cary – 50 установлено, что максимум поглощения находится при длине волны 325 нм. 11 Метод определения аскорбиновой кислоты и витамина В1 описан выше в подразделе «качественное определение БАВ методом ВЭЖХ» Исследование анатомо-диагностических признаков травы звездчатки средней. Результаты исследования анатомо-диагностических признаков различных органов травы зездчатки средней (стебля, листа, чашелистиков) представлены на рисунках 1-6. Рисунок 1 - Фрагмент эпидермиса стебля с устьицами и простыми волосками. Ув. х 125. Рисунок 2 - Фрагмент эпидермиса нижней стороны листа. Ув. х 250. Рисунок. 3 - Фрагмент листа с головчатыми волосками. Ув. х 70 Рисунок 4 - Фрагмент паренхимы листа с друзами. Ув. х 250 Рисунок 5 - Фрагмент эпидермиса верхней стороны чашелистика. Ув. Х 250 Рисунок 6 - Фрагмент эпидермиса нижней стороны чашелистика с головчатыми волосками. Ув. х 70. 12 Исследование качественного состава и количественного содержания биологически активных веществ травы звездчатки Качественное определение БАВ ( флавоноидов, витаминов, аминокислот, углеводов) в траве звездчатки проводили с помощью ВЭЖХ. Идентификацию компонентов проводили по характеру совместимости спектров поглощения каждого хроматографического пика и по времени удерживания раствора РСО. Установлено наличие: 1 - витамин В 1 (вр. выхода 1,1 мин); 2 - аскорбиновая кислота (вр. выхода 2,7 мин); 3 - галловая кислота (вр. выхода 11,8 мин); 4 - эллаговая кислота (вр. выхода 18,5 мин); 5 - рутин (вр. выхода 21,0); 6 - ксантотоксин (вр. выхода 24,0 мин); 7 - кверцетин (вр. выхода 29,9 мин). Методом ВЭЖХ из травы звездчатки средней выделены флавоноидные соединения. Методом масс-спектрометрии установлено их химическое строение. Результаты представлены на рисунке 7. 03-Jul-2013 03:25:00 QBA127 20mg/ml zvezd m/z 200 400 600 800 1000 1200 1400 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 % 0 100 DMP-030713-2 243 (2.211) Cm (239:249-250:258) 1: Scan ES+ 1.18e6 933.77 771.74 433.38 177.04 651.43 1260.47 DMP-030713-2 228 (2.075) Cm (225:234-211:221) 1: Scan ES+ 1.22e6 933.42 771.39 475.57 207.26 1204.89 DMP-030713-2 196 (1.783) Cm (193:200-(182:189+203:211)) 1.99e6 433.31 313.32 595.58 922.85 732.68 1108.35 1426.11 DMP-030713-2 159 (1.446) Cm (154:166-170:179) 1: Scan ES+ 3.00e6 433.38 313.11 198.24 595.44 757.39 1112.62 884.77 DMP-030713-2 148 (1.346) Cm (141:150-121:134) 1: Scan ES+ 1.93e6 457.31 173.55 595.30 955.47 758.30 1316.82 03-Jul-2013 03:25:00 QBA127 20mg/ml zvezd Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 AU 0.0 2.0e-1 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 % 0 100 DMP-030713-2 1: Scan ES+ 313 2.20e7 1.46 0.44 0.98 1.78 2.24 2.61 3.07 2.84 DMP-030713-2 1: Scan ES+ 433 2.94e7 1.43 0.98 1.78 1.64 2.39 2.06 2.70 DMP-030713-2 1: Scan ES+ 457 2.77e7 1.35 0.44 2.22 1.56 1.98 2.71 DMP-030713-2 1: Scan ES+ 595 2.06e7 1.45 0.45 1.06 1.78 2.21 2.71 DMP-030713-2 1: Scan ES+ 757 1.75e7 1.46 0.771.01 3.06 2.35 1.95 DMP-030713-2 1: Scan ES+ 771 1.14e7 2.21 0.47 1.38 2.38 2.79 DMP-030713-2 1: Scan ES+ 933 2.16e7 2.20 2.43 2.70 DMP-030713-2 2: Diode Array 335 Range: 2.299e-1 1.43 0.31 2.19 1.76 O O O H O OH OH OH OH O OH O OH OH O H O H O O O H O OH OH OH OH O OH O OH OH O H O O OH OH O H O H Marginatoside O O O H O OH OH OH OH O OH O OH O O H O O OH OH O H O O OH OH O H O H C H 3 O O O H O OH OH OH OH O OH O OH O O H O O OH OH O H O O OH OH O H O H C H 3 13 Рисунок 7 - Результаты анализа извлечения из травы звездчатки средней методом ВЭЖХ/МС. Для четырех из 5-ти мажорных компонентов экстракта предполагается одна из возможных структур на основании фрагментации ионов. Показательно, что ни в одном из пиков не наблюдается фрагментация до агликона. Схема фрагментации пика с временем удерживания 1,43 мин: O O O H O OH OH OH OH O OH O OH OH O H O H O O O H O OH OH OH OH O H OH O O CH 3 O H O OH OH M+H=495 M+H=433 M+H=313 O O O H O OH OH OH OH O OH O OH OH O H O O OH OH O H O H Marginatoside M+H=757 vitexin Аналогичная схема фрагментации пика с временем удерживания 1,76 мин: O O O H O OH OH OH OH O OH O OH OH O H O H O O O H O OH OH OH OH O H OH O O CH 3 O H O OH OH M+H=495 M+H=433 M+H=313 vitexin Два пика с молекулярным ионом 933 отличаются только временем удерживания и совпадают по схемам фрагментации. Можно предположить, что структурное различие этих соединений обусловлено различием углеводного фрагмента (включает фрагменты глюкозы, или, например, галактозы, или положением метильной группы – при 2-ом или 3-ем остатке глюкозы, и т.д.): O O O H O OH OH OH OH O OH O OH O O H O O OH OH O H O O OH OH O H O H C H 3 M+H=933 M+H=771 M+H=433 O O O H O OH OH OH OH O H OH O O O H O OH OH OH OH O OH O OH O O H O O OH OH O H O H C H 3 Структура пика со временем удерживания 1,35 мин неизвестна. 14 Согласно данным литературы в траве звездчатки средней содержится витексин и его изомер сапонаретин. Следовательно, можно предположить, что при фрагментации ионов пика со временем удерживания 1,43 и фрагментации пика со временем удерживания 1,76 в одном случае получается флавоноид витексин, а в другом – изомер сапонаретин. В результате проведенных исследований из травы звездчатки средней выделены 5 флавоноидных соединений и установлена их химическая структура. Для количественного определения флавоноидов в траве звездчатки средней была использована методика с использованием спектрофотометрического метода, указанного в разделе «объекты и методы». В качестве стандарта использовали лютеолин-7-гликозид. Для расчета содержания флавоноидов был использован удельный показатель поглощения лютеолин-7-гликозида равный 401, взятой из нормативной документации («Полыни горькой настойка» ФСП № 003336/01- 290411) Проведена статистическая обработка результатов, с помощью разработанной методики. Ошибка единичного определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ±4,5%. Отсутствие систематической ошибки доказано опытом с добавкой лютеолин-7-гликозида. Разработанная методика использована для анализа сырья заготовленного в разных регионах России, разных органов растения, для анализа сырья на разных стадиях вегетации. Результаты представлены в табл. 1,2,3. Таблица 1 Результаты количественного определения флавоноидов в траве звездчатки средней № п/ п Место заготовки Содержание флавоноидов, % № п/п Место заготовки Содержание флавоноидов, % 1 Московская обл. 0,468 ±0,021 6 Рязанская обл. 0,298±0,013 2 Московская обл. 0,612±0,027 7 Кировская обл. 0,223±0,010 15 3 Московская обл. 0,720±0,032 8 Пермский край 0,362±0,016 4 Пермский край 0,314±0,014 9 Пермский край 0,451±0,020 5 Тамбовская обл. 0,626±0,029 Таблица 2 Содержание флавоноидов в разных частях растения звездчатки средней n- 5 p-0,95 Содержание флавоноидов, % корни стебли Листья цветки с плодами 0,066±0,001 0,098±0,002 0,628±0,013 0,106±0,002 Прим. В связи маленьким размером цветков и плодов их не разделяли. Как показывают данные таблицы 2, наибольшее содержание флавоноидов в листьях звездчатки, наименьшее – в корнях. Таблица 3 Содержание флавоноидов в звездчатки средней по стадиям вегетации n- 5 p-0,95 Название стадии вегетации Содержание флавоноиодов, % Начало стадии вегетации (5-6 листочков) 0,447±0,009 Начало цветения 0,245±0,005 Конец цветения и нач. плодонашения 0,720±0,014 Из таблицы 3 видно, что наибольшее содержание флавоноидов на конечной стадии вегетации – в конце цветения и в начале плодоношения, когда достаточно развиты листья, которые, в основном, определяют содержание флавоноидов в сырье. Определение углеводов и аминокислот Свободные углеводы анализировали методом прямофазной ВЭЖХ с рефрактометрической детекцией. В качестве свободных углеводов в траве звездчактки содержится глицерол, глюкоза и фруктоза (табл.4). Содержание 16 связанных углеводов определяли методом капиллярного электрофореза. Связанные сахара представлены арабинозой, ксилозой, глюкозой и галактозой. Результаты представлены на рисунке 8 и в таблице 4. dad1A.ch 20 15 10 5 0 Retention Time ( min) 80 160 240 320 400 480 Re sp on se d- m an no se -P M P glu co sa m ine -P M P glu co se -P M P d- xy los e- PM P d- ga lac tos e- PM P d- ar ab ino se -P M P Name tR(min) Peak AreaArea Percent d-mannose-PMP 5.56 3.982e+6 17.1 glucosamine-PMP 7.56 2.435e+6 10.4 glucose-PMP 9.91 3.700e+6 15.9 d-xylose-PMP 11.06 4.478e+6 19.2 d-galactose-PMP 12.64 3.116e+6 13.4 d-arabinose-PMP 13.55 4.294e+6 18.4 Рисунок 8 – Хроматограмма смеси стандартов. dad1A.ch 20 15 10 5 0 Retention Time ( min) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Re sp on se d- m an no se -P M P glu cos am ine -P M P glu co se -P M P d- xy los e- PM P d- ga lac tos e- PM P d- ar ab ino se -P M P Name tR(min) Peak AreaArea Percent d-mannose-PMP 5.57 2.751e+4 0.8 glucosamine-PMP 7.57 1.673e+6 48.4 glucose-PMP 9.91 1.038e+5 3.0 d-xylose-PMP 11.07 1.865e+4 0.5 d-galactose-PMP 12.65 7.519e+4 2.2 d-arabinose-PMP 13.53 5.467e+4 1.6 Хроматограмма гидролизата извлечения из травы звездчатки. Таблица 4 Результаты определения свободных и связанных сахаров в траве звездчатки средней n- 5 p-0,95 № образца Содержание свободных сахаров, % глицерол глюкоза фруктоза общая сумма 1 0,130±0,030 0,320±0,006 0,520±0,010 0,980±0,020 2 0,150±0,003 0,330±0,007 0,550±0,010 1,030±0,020 3 0,110±0,002 0,350±0,007 0,530±0,010 0,990±0,020 № п \ п Содержание связанных сахаров, % Пентозы Гексозы общая сумма арабиноз а ксилоза сумма глюкоза галактоза Сумма 1 2,10±0,04 0,70±0,01 2,80±0,05 3,06±0,06 2,10±0,04 5,16±0,10 7,96±0,16 2 2,20±0,04 0,50±0,01 2,70±0,05 3,00±0,06 2,30±0,04 5,30±0,10 8,00±0,16 3 2,30±0,05 0,70±0,01 3,00±0,06 3,20±0,06 2,50±0,05 5,25±0,10 8,25±0,16 17 В результате проведенных исследований в траве звездчатки установлено наличие глицерола 0,11 - 0,15 %, глюкозы 0,32 - 0,35 %, фруктозы 0,53 - 0,55 %. Общее содержание свободных сахаров 0,98 – 1,03 %. Связанные сахара в траве звездчатки представлены: арабинозой – 2,1- 2,3%; ксилозой - 0,5-0,7%; глюкозой – 3,00-3,20%; галактозой – 2,1-2,5%. Общее содержание связанных сахаров 7,96-8,00 %. Результаты качественного и количественного определения аминокислот в сырье звездчатки представлены на рисунке 9. Рисунок 9 - 1 - Хроматограмма стандартных растворов аминокислот. 2 – Хроматограмма извлечений из травы звездчатки средней. Как следует из эксперимента, в траве звездчатки средней содержится 20 аминокислот. Мы определили сумму свободных и связанных аминокислот. Преобладающими кислотами в траве звездчатки средней являются глютаминовая кислота- 21,94 %, аспарагиновая кислота- 15,45 %, пролин - 10,57 %, оксилизин - 5,92 %, валин - 5,69 % от суммы свободных кислот. Определение аскорбиновой кислоты и витамина В 1 Определение аскорбиновой кислоты и витамина В1 проводили методом ультраэффективной жидкостной хроматографии/масспектрометрии на хроматографе Waters Acquility с тандемным квадрупольным МС-детектором TQD (Waters). Показано, что ошибка единичного определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ±4,52%. Отсутствие систематической ошибки доказано опытом с добавкой аскорбиновой кислоты. 18 С помощью разработанной методики были проанализированы 4 образца травы звездчатки на содержание аскорбиновой кислоты и витамина В 1 Полученные результаты представлены в таблице 5. Таблица 5 Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты и витамина В 1 № образца Площади пиков аскорбиновой кислоты Содержание аскорбиновой кислоты мг/% Площади пиков витамина В 1 Содержание витамина В 1 , мг/% 1 116915 52,2 36471 11,0 2 97425 43,5 38999 11,8 3 89902 38,8 33902 10,2 4 90485 40,4 42940 12,9 Из таблицы 5 видно, что содержание аскорбиновой кислоты в траве звездчатки колеблется от 38,8 до 52,2 мг/%, витамина В 1 от 10,2 до 12,9 мг/%. Качественное обнаружение и количественное определение сапонинов Сапонины обнаруживали методом ТСХ на пластинках Сорбфил–ПТСХ– А-Ф-А-УФ в системе растворителей н-бутанол – кислота уксусная ледяная – вода (5:1:4). В качестве стандарта использовали эсцин. Зоны адсорбции выявляли 10 % раствором серной кислоты в 40 % этаноле при нагревании в сушильном шкафу при 100 0 С в течение 5 мин. На хроматограмме испытуемого раствора обнаружена зона адсорбции эсцина с Rf 0,24 и не менее 5 зон адсорбции с Rs = 1,9; Rs = 1,6; Rs =1,0; Rs=0,67; Rs =0,41. Количественное определение тритерпеновых сапонинов проводили спектрофотометрическим методом, описанном в разделе «объекты и методы». В качестве стандарта был использован эсцин. При снятии спектров поглощения эсцина и извлечения из травы звездчатки средней с кислотой серной концентрированной установлено, что максимум поглощения находится при 19 длине волны 325±3нм и что максимумы эсцина и извлечения из травы звездчатки совпадают. Результаты представлены на рисунке 10. Рисунок 10 - спектры поглощения раствора эсцина и извлечения из травы звездчатки средней. 1 - 0,1% раствор эсцина в 95 % этаноле 2 - извлечение из травы звездчатки средней Далее с помощью калибровочного графика установлены рабочие концентрации, время прохождения реакции и ее стабильность, а также полнота экстракции сапонинов от условий экстракции и очистки сапонинов от сопутствующих веществ. Получение настоек гомеопатических матричных и их стандартизация Сырьем для получения гомеопатических матричных настоек служила как свежая, так и высушенная трава звездчатки средней. Настойку гомеопатическую матричную из свежего сырья готовили способом мацерации по методу 2а ОФС 42-0027-05 с использованием 86 % этанольного спирта (по массе), так как влажность сырья более 80 %, согласно литературным данным сырье не содержит эфирных масел, смол и слизи. Настойку гомеопатическую матричную из высушенного сырья получали методом перколяции по методу 4а ОФС 42-0027-05 с использованием спирта этилового 62 % (по массе) или 70 % спирта этилового (по объему 1 : 10). Настойки гомеопатические матричные из свежего и высушенного сырья имеют схожие внешние признаки: прозрачная жидкость зеленовато– коричневого цвета со специфическим запахом. 2 1 20 Требования к качеству сырья и настоек включены в проекты НД. Проекты НД на НГМ содержат следующие показатели: «получение», «описание», «подлинность», «сухой остаток», «плотность», «тяжелые металлы», «микробиологическая чистота», «количественное определение», «хранение», «срок годности». Определение подлинности настойки гомеопатической матричной проводили методом тонкослойной хроматографии, по методике, описанной при анализе сырья. Для количественного определения сапонинов в настойках применена модифицированная методика использованная для анализа сапонинов в траве звездчатки средней. Сравнительные данные качества настоек, полученных из свежего и высушенного сырья, представлены в таблице 6. Таблица 6 Сравнительные результаты качества настоек, полученных из свежего и высушенного сырья № образ ца Показатели качества Плотность Сухой остаток, % Содержание сапонинов, % свежее сырье высушен сырье свежее сырье высуш сырье свежее сырье высуш сырье 1 0,9489 0,9202 2,17 2,52 0,33 0,49 2 0,9488 0,9146 1,43 2,00 0,35 0,41 3 0,9463 0,9165 1,28 2,00 0,28 0,43 Сравнительный анализ настоек показал, что настойка из высушенной травы содержит большее количество БАВ. Для установления срока годности настойки, образцы после проверки по всем показателям, указанным в проекте НД, были поставлены на хранение в условиях и упаковке, предусмотренных проектом НД. Каждые 6 месяцев проводили анализ образцов. Установлено, что образцы настоек изменялись 21 незначительно после 2,5 лет хранения и удовлетворяли требованиям проекта НД. По результатам изучения стабильности при хранении по показателям, предложенным в проекте НД, предлагаем установить срок годности 2 года. ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. Проведено информационно-аналитическое исследование данных литературы и нормативных документов по требованиями к качеству сырья и матричных настоек звездчатки средней. Выявлены основные показатели качества сырья и настоек. 2. При проведении морфолого-анатомического изучения свежей и высушенной травы звездчатки средней установлены значимые анатомо- морфологические признаки листьев, стеблей, цветков и плодов, которые охарактеризованы количественно (определены размеры клеток, устьиц, волосков, железок, друз). 3. Методами ВЭЖХ и МС проведены исследования флавоноидов в ЛРС звездчатки средней. Определены следующие соединения: рутин, кверцетин, апигенин, лютеолин, витексин, ксантотоксин. Впервые обнаружены 3 новых для этого растения флавоноидных соединения: 1). 4,5,7-тригидрокси-8-(β-D- глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил-(1→6)-3-О-метил-β-D- глюкопиранозил) флавон; 2). 4,5,7-тригидрокси-8-(β-D-глюкопиранозил-(1→6)- β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил) флавон; 3). 4,5,7- тригидрокси-8-(β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил) флавон. Разработана ВЭЖХ-методика количественного определения флавоноидов в ЛРС. Установлено, что наибольшее количество флавоноидов (0,628%), содержится в листьях растения, наименьшее – в корнях 0,066 %. Изучена динамика накопления флавоноидов в ЛРС в течение вегетационного периода. Установлено, что наибольшее количество их содержится в траве в фазу цветения – начало плодоношения (до 0,72 %). 22 4. С помощью современных физико-химических методов изучен качественный состав сапонинов в траве звездчатки средней. Подобраны оптимальные условия анализа и разработаны методики качественного и количественного определения в сырье суммы сапонинов. Методом спектрофотометрии определено их содержание от 3,75 до 6,08 %. 5. Исследован аминокислотный состав сырья. Идентифицированы 20 аминокислот. Основными являются: пролин, триптофан, цистин, цистеин, аргинин, глутамин, аспарагин. Методами ВЭЖХ и капиллярного электрофореза определено содержание свободных и связанных сахаров; установлено, что преобладают связанные сахара. В свободном виде в траве звездчатки средней преобладают нейтральные сахара (манноза, глюкоза, галактоза, галактуроновая кислота). Изучено содержание в ЛРС витаминов. Методом ВЭЖХ определено содержание аскорбиновой кислоты (до 0,0522 %), тиамина гидрохлорида (витамина В1) – до 0,0129 %. 6. Впервые получены настойки гомеопатические матричные из свежего сырья (методом мацерации) и высушенного сырья (методом перколяции) и первого и второго десятичных разведений. Дана их характеристика. 7. Разработаны методики стандартизации настоек гомеопатических матричных из травы звездчатки средней. Установлены числовые показатели качества для НГМ, первого и второго десятичных разведений и срок годности двух видов НГМ (до 2 лет). 8. Разработаны и оформлены проекты 4 нормативных документов на: «Звездчатки средней трава свежая Stellariae mediae herba recens»; «Звездчатки средней трава Stellariaе mediae herba»; «Звездчатки настойка гомеопатическая матричная Stellariae tincture homeopathica materna» (из свежего сырья); «Настойка гомеопатическая матричная Stellaria media» (из высушенного сырья). Нормативная документация направлена в «Центр фармакопеи и международного сотрудничества - ФГБУ НЦЭСМП». 23 Практические рекомендации Полученные данные по содержанию в изучаемом сырье БАВ могут служить теоретической базой для создания новых лекарственных препаратов из травы звездчатки средней. Перспективы дальнейшей разработки темы Перспективным является более углубленное исследование биологической активности биологически активных веществ звездчатки средней на различных моделях. Также представляет интерес создание новых лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья звездчатки средней. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Наумов, А.В. Качественное и количественное определение углеводов в траве звездчатки средней (мокрицы) (Stellaria media L.) / Наумов А.В., Попов Д.М. // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, - 2010. -№ 7, - С. 157-160. 2. Наумов, А.В. Исследование аминокислотного состава звездчатки средней (мокрицы) / Наумов А.В., Попов Д.М. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. – 2011. - № 5, - С. 46-48. 3. Наумов, А.В. Исследование звездчатки средней методом ВЭЖХ / Наумов А.В., Попов Д.М. // Фармация. - 2012. - № 2. - С. 27-29. 4. Наумов, А.В. Определение витаминов в траве звездчатки средней / Наумов А.В., Попов Д.М. // Фармация. – 2012. - № 4 - С. 21-23. 5. Наумов, А.В. Исследование анатомо - диагностических признаков травы звездчатки средней / Наумов А.В., Потанина О.Г., Попов Д.М. // Сб. Инновационные процессы в лекарствоведении, Ярославль, 2012. - С. 232-234. 6. Наумов, А.В. Определение тритерпеновых сапонинов в траве звездчатки средней хромато - спектрометрическим методом / Наумов А.В., Попов Д.М. // Сеченовский вестник. – 2014. - № 1(15). - С. 134. 7. Наумов, А.В. Исследование качественного состава флавоноидных соединений в траве звездчатки средней / Наумов А.В. // Разработка и регистрация лекарственных средств. – 2014. - № 2(7). - С. 108-112. 8. Наумов А.В.. Исследование качественного состава флавоноидов в траве звездчатки средней/ Наумов А.В., Попов Д.М. // Сборник материалов 25 Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине»(22-23 января 2015 г.) – Москва ,2015.- С.195-196 24 9. Наумов, А.В. Сравнительное изучение показателей качества гомеопатических матричных настоек звездчатки средней (Stellaria media (L) Vill) / Наумов А.В., Наумова О.А// Сборник материалов 27 Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (26-27 января 2017 г.) – Москва,2017– С. 184 Список сокращений: БАВ - биологически активные вещества ГФ - Государственная Фармакопея ЛРС - лекарственное растительное сырье ОФС - общая фармакопейная статья МС - масс-спектрометрия ТСХ - тонкослойная хроматография УФ - ультрафиолетовый ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография НД – нормативный документ |