Ферментативная активность микроорганизмов. Ферментативная активность микроорганизмов
 Скачать 169.88 Kb.
|
  Ферментативная активность микроорганизмов Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на дифференциально-диагностические питательные среды, которые в зависимости от состава и своего назначения можно разделить на 4 группы. Среды с сахарами или многоатомными спиртами, для определения сахаролитической активности микроорганизмов. Среды, содержащие белковые вещества (желатину, молоко, свернутую сыворотку крови, куриный белок и т. д.) для выявления протеолитических ферментов. Среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами. Среды, содержащие индифферентные химические вещества, являющиеся источником питания одних видов и не ассимилируемые другими видами микробов. В состав дифференциально-диагностических сред обычно вводят индикатор, указывающий на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий «сахара» расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества. Сахаролитические свойства, т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа Эти свойства изучают на: жидких и полужидких средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах. на плотных средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы сбраживают до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу) и образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны. на средах с крахмалом (среда Кодама) определяют микроорганизмы, образующие амилазу. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание. молоко при росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается. среда Вильсон-Блера. Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na2S04, хлористое железо FeCl . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара При этом осуществляется восстановление сернистокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Разрыв питательной среды связан с расщеплением глюкозы до газа. Микротест - системы (МТС).Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально- диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях. Протеолитические свойства - способность расщеплять белкиизучают: на средах с желатином. В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитический фермент выявляется путем разжижения желатины. на средах с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки. на средах с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты. Гемолитические свойствамикроорганизмов изучают на питательных средах с добавлением эритроцитов (кровяной МПА - для культивирования аэробов, среда Цейсслера - для культивирования анаэробов). На плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона гемолиза. Каталазная активность. Каталаза - это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают кашпо перекиси водорода и суспензируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде III этап. Проверка культуры на чистоту (макроскопическим - однородный рост, микроскопическим — однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признаками клетки). IV этап. Идентификация проводится по: - ферментативным свойствам - антигенным свойствам, токсигенности и другим признакам - фагочувствительности (с целью повышения чуствительности микроорганизмов к бактериофагам, выращивание осуществляют в присутствии вещества, снижающего антилизоцимную активность микроорганизмов) Идентификация —определение (установление) видовой принадлежности микроба. В настоящее время общепринятый метод идентификации основан на изучении определенного набора наиболее важных фенотипических признаков исследуемого микроорганизма. Критерием для идентификации является наличие у микроба совокупности основных признаков, характерных для данного вида (таксонометрических признаков). Установление вида производится согласно международной таксономии бактерий (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology). К основным видовым признакам бактерий относятся: морфология микробной клетки; тинкториальные свойства — особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски; культуральные признаки — особенности роста микроба на питательных средах; биохимические признаки — наличие у бактерий ферментов, необходимых для синтеза или расщепления (ферментации) различных химических соединений. В бактериологической практике чаще всего изучают сахаролитические и протеолитические ферменты. К дополнительным признакам, используемым при идентификации, относятся: наличие видоспецифических антигенов ; чувствительность к видоспецифическим бактериофагам видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам. для патогенных бактерий — продукция определенных факторов вирулентности Тонкая внутривидовая идентификация до биовара (серовара, фаговара, ферментовара и т.д.) — титрование — основана на выявлении соответствующего маркера: антигена (серотипирование), чувствительности к типовому бактериофагу (фаготипирование) и др. В последние годы разработаны и начали применяться современные биохимические и молекулярно-биологические методы идентификации: хемоидентификация, анализ нуклеиновых кислот: рестрикционный анализ, гибридизация, полиме-разная цепная реакция (ПЦР), риботипирование и др. Биохимическая идентификация. Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции: 1) ферментацию — неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов, например ферментацию углеводов с образованием органических кислот; окисление — полное расщепление органического субстрата до СОг и НгО; ассимиляцию (утилизацию) — использование субстрата для роста в качестве источника углерода или азота; диссимиляцию (деградацию) субстрата; гидролиз субстрата. Классический (традиционный) метод идентификации микробов по биохимическим признакам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследование занимает не менее 1 сут. Примером является оценка сахаролитической активности бактерий (способности ферментировать углеводы) с помощью посева на среды Гисса — короткий и длинный "пестрый ряд". Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда". Короткий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор (реактив Андреде или др.), позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления (органических кислот), и "поплавок" для обнаружения выделения Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом". Для определения протеалитических ферментовпроизводят посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20 % желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22 *С в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя фигуру, напоминающую воронку или елочку. В посевах в пептонную воду определяют продукты расщепления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 сут при 37 "С путем постановки реакций на аммиак, индол, сероводород и др. Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бумаги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака. Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2—3 мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо . Реакция на сероводород. В пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, смоченную сульфатом железа, и закрепляют ее под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. При выделении сероводорода образуется нерастворимый сульфид железа (FeS), окрашивающий бумагу в черный цвет. Продукцию HjS можно определять также путем посева культуры бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления fyS (смесь солей: сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). Положительный результат — среда приобретает черный цвет за счет образования FeS. Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1—3 % раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного вида бактерий каталазы. В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их идентификации. При необходимости исследуют другие признаки, например способность к восстановлению нитратов, карбоксилированию аминокислот, образованию оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и других ферментов. Результаты работ по идентификации выделенной культуры протоколируют. Биохимические тесты 2-го поколения, основанные на применении концентрированных субстратов и более чувствительных методов обнаружения конечных продуктов реакции, позволяют выявлять ферменты, уже существующие в микробной клетке, и, таким образом, не требуют дополнительного выращивания бактерий в процессе исследования. Это позволяет существенно сократить сроки исследования (до 4 ч). Биохимические тесты 3-го поколения основаны на применении субстратов, меченных хромогеном или флюорохромом. Такой комплекс не окрашен или не флюоресцирует. При разрушении меченого субстрата ферментом микроба освобождается метка, что проявляется окрашиванием или флюоресценцией. Такие тесты позволяют использовать единичную бактериальную колонию, полученную при первичном посеве исследуемого материала на плотную питательную среду, для полной биохимической идентификации, т.е. сокращает процесс выделения чистой культуры до двух этапов. В лабораторной практике применяются готовые микротест-системы (МТС) для идентификации основных групп микроорганизмов — возбудителей заболеваний человека. В современных МТС учет результатов и их интерпретация осуществляются автоматически с помощью компьютерных систем анализа. Биохимические и молекулярно-генетические методы идентификации. Хемоидентификация — идентификация по химическому составу микробной клетки. В состав любого организма входят 4 основных класса биомолекул: нуклеиновые кислоты, белки, углеводы и липиды. Хемоидентификация основана в первую очередь на анализе состава микробных липидов, поскольку среди биополимеров они характеризуются наибольшим разнообразием мономеров (у различных бактерий обнаружены более 300 разных типов жирных кислот и их производных). Это позволяет различать микробы, принадлежащие к разным видам, по количественному и качественному составу липидов (жирных кислот, эфиров, спиртов, хинонов и т.д.). Анализ химического состава микробных клеток осуществляется с помощью метода хроматографии. Наиболее широко используют метод газожидкостной хроматографии. Ведущей областью применения метода являются идентификация анаэробных бактерий по составу жирных кислот с короткой углеродной цепью (9—20 атомов углерода), относящихся к основным продуктам метаболизма этих микроорганизмов, а также идентификация медленно растущих бактерий (микобактерий) и бактерий с низкой ферментативной активностью. Молекулярно-генетические методы идентификации. Они основаны на анализе бактериальных ДНК. Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывают рестрикционными ферментами — специфическими эндонуклеазами, которые разрезают молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. Далее проводят анализ полученных фрагментов, уникальных для каждого вида микроорганизма. Метод также позволяет осуществлять внутривидовое типирование бактерий. Гибридизация ДНК. Любой микроорганизм имеет в своем геноме определенные уникальные последовательности, которые могут быть использованы для его идентификации. Метод обнаружения таких участков ДНК основан на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов — однонитевых фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам микробного генома и несущих метку (радионуклид, фермент или флюорохром). Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими. Быстрота и высокая чувствительность метода гибридизации позволяют существенно сократить время исследования. Основной областью применения является идентификация трудно культивиру емых или медленно растущих микробов (например, представителей родов Mycobacterium, Neisseria, Campyiobacter). Особо следует выделить метод риботипирования — идентификации, основанной на анализе генов, кодирующих рибосомальные РНК. 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные последовательности ДНК, присутствующие в образце в очень малых количествах. Теоретически достаточно одной копии искомой последовательности. Метод ПЦР основан на амплификации (увеличении числа копий) искомого участка генома микроорганизма. |