Презентация 6. Ферменты биологоические катализаторы основную функциональную нагрузку в качестве ферментов в живых организмах несут белки

• Название: Ферменты биологоические катализаторы основную функциональную нагрузку в качестве ферментов в живых организмах несут белки
• Дата: 18.11.2022
• Размер: 6.2 Mb.
• Имя файла: Презентация 6.pptx
• Тип: Документы; #795436

ФЕРМЕНТЫ – БИОЛОГОИЧЕСКИЕ КАТАЛИЗАТОРЫ

Основную функциональную нагрузку в качестве ферментов в живых организмах несут белки.

Суть действия ферментов в снижении энергии активации. Фермент при этом не расходуется, и равновесие реакции не сдвигается.

Разность между значениями энергии в основном и переходном состояниях называется энергией активации. Чем выше энергия активации, тем медленнее протекает реакция. Энергия активации – энергетический барьер химической реакции.

Ускорение реакции под действием уреазы

Рентгеноструктурный анализ (РСА)

Один из основных методов исследования активных центров и механизма действия ферментов. В основе метода лежит явление дифракции ренгеновских лучей на кристаллической решетке. Анализ структуры фермент-субстратных комплексов в кристалле. Эффективен в сочетании с сайт-направленным мутагенезом и изучением кинетики действия ферментов. Требуется не более 10 мг белка для кристаллизации.

Разрешение, Å	Выявляемая структура
5,5	Общая конфигурация молекулы. Спирали в виде интенсивно рассеивающих лучи палочек
3,5	Полипептидный остов, нечетко
3,0	Боковые цепи, нечетко
2,5	Разрешение боковых цепей, плоскости пептидной группы. Расположение атомов может быть определено с точностью ± 0,4 Å
1,5	Расположение атомов может быть определено с точностью ± 0,1 Å

Сайт-направленный мутагенез – один из наиболее информативных методов изучения структуры и функции белков и ферментов.

Мутации в определенных сайтах создаются с помощью совокупности методов, основанных на генно-инженерных подходах. Метод возник в 70-х годах в результате развития методов химического синтеза олигонуклеотидов и методов секвенирования. Необходимо знать первичную последовательность белка.
Позволяет получать белки и ферменты с измененными свойствами и идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков.

Молекулярный докинг – молекулярная стыковка

Поиск новых лекарственных препаратов. Драг дизайн.


Молекулярный докинг – это позиционирование низкомолекулярного соединения (лиганда) в активный центр белка. Оптимизация положения лиганда внутри активного центра производится по результатам оценки энергии взаимодействия лиганда с макромолекулой. Вычисление энергии производится исходя из заранее приготовленной сетки потенциалов.

Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата/переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и мутантных форм.

Фермент	Kcat (c⁻¹)	KM для АTФ	Kcat /KM (c⁻¹ M⁻¹)
WT (Thr51)	7.6/4.7	0.9/2.5	8.4/1.86
Ala51	8.6/4.0	0.54/1.2	15.9/1.86
Pro51	12.0/1.8	0.058/0.019	208.0/95.8

Wilkinson A.J., Fersht A.R., Blow D.M., Carter P., Winter G. A large increase in enzyme-substrate affinity by protein engineeting//Nature. 1984. V.307. P.187-188.

С помощью сайт-направленного мутагенеза можно получать более совершенные ферменты, обладающие высокой каталитической активностью.

Механизм действия гидролазы лизоцима. Субстрат – пептидогликаны –углеводы клеточных стенок бактерий.

Мм от 15 до 23 кДа, 129 а.о. Избирательно гидролизует гликозидные связи в муреине.
Молекула лизоцима удерживается четырьмя дисульфидными мостиками и имеет длинную расщелину, в которой расположен его активный центр.


В зоне связывания субстрата образуется комплекс между ферментом и шестью последовательно расположенными моносахаридными звеньями A-B-C-D-E-F .
Звено D нельзя разместить в зоне связывания фермента в обычной для моносахаридов конформации “кресла“ – оно не укладывается в субстратную щель из-за помех, вызванных слишком близкими контактами атомов этого звена с лизоцимом. Эти помехи, однако, полностью снимаются, если звено D изменит свою конформацию и перейдет в напряженную конформацию “полукресла”.
Происходит сближение гликозидной связи, соединяющей звенья D и E, с карбоксильной группой остатка Glu-35, который входит в активный центр фермента.


Протон карбоксильной группы Glu-35 переносится на сближенный с ним кислород гликозидной связи (соединяющий кольцо D и Е субстрата). В результате связь кислорода с кольцом D разрывается.
Углерод, находящийся в положении 1 кольца D, образует карбониевый ион, который стабилизируется отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка 52 (остаток аспарагиновой кислоты).
Далее карбокатион подвергается атаке молекулой воды, которая поляризуется анионом остатка Glu35. Glu35 отрывает протон, а образовавшийся гидроксил-ион атакует несущий положительный заряд атом С1.

Основные черты механизма действия лизоцима:

- организация системы нековалентных взаимодействий, фиксирующих протяженный субстрат;
- стерические ограничения на связывание именно того звена в субстрате, гликозидная связь которого расщепляется, перевод его в необычную конформацию;
- согласованное действие двух карбоксильных групп, одна из которых выступает в качестве протона, а другая в анионной форме способствует стабилизации карбокатиона в переходном комплексе.


Ферменты – сложные белки – называются двухкомпонентными. Активный комплекс двухкомпонентного фермента назвается холофермент (холоэнзим). Термолабильная белковая часть называется апоферментом, термостабильная – кофактором.
Обычно кофакторами называют небелковые компоненты, которые могут легко отделяться от белка, а простетическими группами - небелковые компоненты, ковалентно связанные с белком, которые можно отделить только при воздействии денатурирующих факторов.

В роли кофакторов могут выступать ионы металлов ( > 25% ферментов)

Fe2+ или Fe3+ Zn2+ Cu2+ Co Mg2+ Mn2+
Ионы металла выполняют функцию стабилизаторов молекулы субстрата, активного центра фермента и конформации белковой молекулы фермента, а именно третичной и четвертичной структур.
Участие в электрофильном катализе и в окислительно-восстановительных реакциях
Участие в регуляции aктивности ферментов

В роли коферментов могут выступать органические соединения.

Витаминные кофакторы: рибофлавин, тиамин, пантотеновая кислота, никотинамид, пиридоксальфосфат, ретинол, аскорбиновая кислота.
Невитаминные кофакторы: НS-глутатион, липоевая кислота, производные нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринcодержащие вещества.

Классификация

1 класс – оксидоредуктазы, окислительно-восстановительные реакции;
2 класс – трансферазы, реакции переноса функциональных групп;
3 класс – гидролазы, реакции гидролиза (расщепление ковалентной связи с присоединением молекулы воды);
4 класс – лиазы, присоединение групп к двойной связи или образование двойной связи путем удаления группы;
5 класс – изомеразы, различные внутримолекулярные превращения;
6 класс – лигазы (синтетазы), реакции усложнения молекул за счет присоединения друг к другу двух молекул с образованием ковалентной связи, при этом используется энергия АТФ или других макроэргических соединений.

L-малат:NAD-оксидоредуктаза (КФ 1.1.1.38)

1. номер класса ферментов
1. тип реакции, окисляется –OH группа
1. наличие кофермента (в данном случае – кофермент NAD+)
38. порядковый номер фермента в данной подгруппе


Коферменты и простетические группы всегда многократно циклически используются в клетке, тогда как субстраты обычно быстро расщепляются и выводятся.

Образование фермент-субстратного комплекса

Активный центр - уникальная комбинация аминокислотных остатков (АО) в молекуле фермента, обеспечивающая непосредственное связывание ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа.
От 1/2 до 2/3 всех АО белка - фермента прямо или косвенно участвует в работе активного центра.

Требования к активным центрам ферментов

Защита фермента от тепловой денатурации

Работу активного центра можно описать двумя стадиями

Стадия 1. Фермент “узнает“, связывает и удерживает субстрат в комплексе.
Kd = k-1/k1 [моль/л]
Чем ниже Kd, тем выше сродство субстрата к ферменту и тем прочнее фермент-субстратный комплекс.

Kd – константа диссоциации комплекса фермента с субстратом

Kd варьирует от 10¯³ (связывание E с S неэффективно) до 10¯¹⁰ (высокоэффективное связывание, прочное, как ковалентное)

Стадия 2. Каталитическое превращение субстрата в продукт.
k2
ES E + P
k2 - kcat [c¯¹] характеризует число оборотов ферментативной реакции.
Kcat определяет максимальное число молекул субстрата, превращающихся в продукт в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом.
Ферменты без кофакторов (трипсин, химотрипсин) работают довольно медленно, величина их kcat до 10² c¯¹.
Ферменты с кофакторами работают с большей эффективностью, величина их kcat до 10⁷ c¯¹.

Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата

Количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью реакции. Уравнение Михаэлиса-Ментен

Vmax – характеризует каталитическую активность фермента, т.е. определяет максимальную эффективность образования продукта при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата.


KM характеризует сродство фермента к субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Сродство фермента к субстрату тем выше, чем ниже значение KM.
В этом случае начальная скорость реакции выше, а значит, равновесие первого этапа ферментативной реакции сдвинуто вправо, в сторону образования ES.
При таких условиях для достижения эффективного превращения субстрата требуется малая концентрация субстрата.

Сравнение каталитических механизмов и эффективности действия ферментов

Коэффициент специфичности


Каталитическое совершенство


При малых концентрациях субстрата (< KM) Kcat/KM равно Vmax/KM
Пространственное распределение частот встречаемости аллелей локуса Саt2: 1- Грузия, Армения, Нахичевань, Дагестан, 2- Азербайджан без Нахичевани, 3- Иран, 4- Туркмения, 5-Афганистан, 6- Узбекистан, 7- Киргизия, Таджикистан, Казахстан, Индия.

Понимание механизмов действия ферментов стимулирует развитие медицины

Большинство лекарств, применяемых для лечения различных болезней, представляют собой ингибиторы ферментов.
Ингибиторы применяют для изучения механизма ферментативного катализа.
Три типа обратимого ингибирования.

Связывание ингибитора (I) в активном центре фермента препятствует связыванию субстрата αKM - кажущаяся константа Михаэлиса

Связывание с I происходит вне активного центра с комплексом ES

I связывается вне активного центра, причем может связываться как с Е, так и с ES

Необратимое ингибирование

Образование ковалентной связи между I и ферментом выводит из строя функциональные группы фермента.
Суицидное ингибирование.

Ингибитор проходит несколько стадий ферментативного превращения, а потом превращается в соединение с очень высокой реакционной способностью, необратимо связывающееся с ферментом.

Регуляция активности ферментов

Аллостерические ферменты катализируют регуляторные (ключевые) реакции данного метаболического пути.
Ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяет осуществлять регуляцию скорости метаболического пути.
Аллостерические модуляторы нельзя путать с ингибиторами, действующими по бесконкурентному или смешанному типу.


Аллостерические ферменты обычно являются олигомерными белками, состоящими из нескольких протомеров.
Имеют аллостерический центр.
Обладают свойством кооперативности.
Регуляторные ферменты катализируют, как правило, начальные реакции метаболического пути, необратимые реакции, скорость-лимитирующие (самые медленные) или реакции в месте разветвления метаболического пути.

Регуляция с помощью обратимой ковалентной модификации – посттрансляционная модификация – ПТМ.

Фосфорилирование, ацетилирование, аденилирование, метилирование, амидирование, карбоксилирование, гидроксилирование, убиквитирование, гликолипирование и др.
Важная роль ПТМ в модификации физиологического статуса растительного организма через регуляцию активности белков, белок-белковых и липид-белковых взаимодействий.

Протеинкиназы катализируют присоединение фосфорильной группы к аминокислотным остаткам белка. Фосфатазы катализируют удаление фосфорильной группы.

Фосфорильная группа присоединяется к остаткам Ser, Thr и Tyr и приводит к внедрению громоздких заряженных групп в слабополярные области белка.
Множественное фосфорилирование позволяет осуществлять тонкую регуляцию.

Регуляция активности ферментов фосфорилированием – дефосфорилированием ОН-групп

Протеинкиназы катализируют присоединение фосфорильной группы к аминокислотным остаткам белка. Донором остатка фосфорной кислоты является молекула АТФ.
Фосфатазы катализируют удаление фосфорильной группы

Регуляция активности протеинкиназы А (ПКА) с помощью белок-белковых взаимодействий

ПКА (цАМФ-зависимая) состоит из 4-х субъединиц двух типов: R – регуляторные и C- каталитические.
R имеют участки связывания для циклического АМФ (цАМФ). Связывание 4-х молекул цАМФ приводит к изменению конформации R и к диссоциации тетрамерного комплекса. При этом высвобождаются две активные каталитические субъединицы.


Регуляция путем протеолитического расщепления предшественника - зимогена
Химотрипсиноген и трипсиноген
Химотрипсин и трипсин
Пепсиноген и пепсин.

Некоторые регуляторные белки используют несколько механизмов регуляции

Бактериальная глутаминсинтетаза катализирует включение восстановленного азота в метаболизм клетки.
Аллостерическая регуляция по механизму обратимой ковалентной модификации с участием не менее 8 модуляторов и дополнительно связывается с другими регуляторными белками.

A B С Д … К …. F АДФ + ФiАТФ

Схема метаболического пути, в котором исходный субстрат А превращается в конечный продукт F. Каждая стадия катализируется определенным ферментом (Е1, Е2 и т.д.).
Значение этого процесса – синтез АТФ.
Однако, если АТФ не расходуется для нужд клетки, соединение С не образуется даже при наличии предшественников.


Предположите, какой фермент является регуляторным в этом процессе? ПО какому признаку его можно определить?
Назовите способ регуляции активности этого фермента, его ингибитор.
Укажите основные особенности строения и функционирования регуляторных ферментов, изобразите схему регуляции их активности.

E1 E2 E3 E4 E5 E E7 F …… En P1

E1 E2 E3 E4 E5 E E7 F …… En P1
S A B C D
E6 G E8 H …… Em P2

Какие ферменты данного метаболического пути могут быть регуляторными и каков механизм регуляции этого пути?

Почему при накоплении вещества Р1 в клетке его синтез замедляется? Возможен ли при этом синтез вещества Р2?

Изобразите схему этого способа регуляции метаболического пути, назовите его, перечислите структурные особенности регуляторных ферментов;

Укажите метаболиты, которые могут взаимодействовать с центрами фермента Е5? Назовите эти центры.

Биотехнологическая компания получила заказ на клонирование аспарагиназы, которая используется в детской онкологии. Были получены 4 различные формы аспарагиназы – фермента, в активном центре которого происходит расщепление аспарагина на аспартат и аммиак. Их Kм и Vм следующие:
- фермент 1: Kм = 0,1 ммоль, Vм = 5 ммоль/мин
- фермент 2: Kм = 0,3 ммоль, Vм = 4 ммоль/мин
- фермент 3: Kм = 0,05 ммоль, Vм = 7 ммоль/мин
- фермент 4: Kм = 0,2 ммоль, Vм = 5 ммоль/мин


Укажите класс фермента;
Дайте определение Kм и Vм, укажите их значимость в выборе нужной формы фермента и рассчитайте эффективность работы каждого препарата, выберите форму препарата, прошедшего отбор.
Объясните, почему этот фермент, введенный в кровь, оказывает губительное действие на злокачественные клетки (установлено, что они не способны синтезировать аспарагин из аспарагиновой кислоты) и не нарушает метаболизм здоровых клеток.


Белки пищи гидролизуются ферментом желудочного сока пепсином. В норме оптимум рН пепсина – 1,5 – 2,0. Почему у больных гипоацидным гастритом, при котором повышается рН желудочного сока, нарушается переваривание белков в желудке?
Укажите, к какому классу и подклассу ферментов относится пепсин и какие связи расщепляет пепсин в белках пищи;
Нарисуйте график зависимости активности пепсина от рН и объясните, что такое оптимум рН ферментов;
Объясните, почему повышение рН желудочного сока снижает активность пепсина и нарушает переваривание белков пищи в желудке.


Болезни, вызванные вирусной или микробной инфекцией, сопровождаются развитием в организме больного воспалительной реакции, которая характеризуется повышением температуры, отечностью, головной болью, покраснением покровов. Эта реакция частично вызвана увеличением выработки гормоноподобных веществ – простагландинов (PG) Усиление синтеза PG происходит в результате активации ключевого фермента –циклооксигеназы (ЦОГ).


Арахидоновая кислота
ЦОГ
PGG
Другие PG (вызывающие воспаление) и тромбоксаны (участвующие в свертывании крови)
Прием ацетилсалициловой кислоты (аспирина) снижает признаки воспаления и улучшает состояние больных. Каков механизм действия аспирина?


Напишите структурную формулу аспирина и укажите, с какой функциональной группой фермента он взаимодействует;
Оцените прочность связи, которая образуется между аспирином и ферментом, укажите, обратима ли инактивация фермента, какова дальнейшая судьба инактивированного фермента;
Почему через несколько часов после приема аспирина симптомы воспаления возобновляются?

Биохимический механизм инактивации циклооксигеназы аспирином

Применение ферментов в медицинне

Энзимодиагностика

Клеточные ферменты практически не проникают из неповрежденных клеток в кровь.

При повреждении мембран клеток (воспаление, некроз) в крови и др. биологических жидкостях увеличивается количество внутриклеточных ферментов поврежденных клеток.

Используют ферменты, имеющие преимущественную ил абсолютную локализацию в определенных органах (органоспецифичность).

Органоспецифичность изоферментов. Лактатдегидрогеназа.

Катализирует реакцию окисления лактата до пирувата.
Изоформы различаются электрофоретической подвижностью, что позволет установить тканевую принадлежность изоформ ЛДГ.

Креатинкиназа, КК

Димер, два типа субъединиц, три изоформы с разной электрофоретической подвижностью.
ВВ – головной мозг
ММ – скелетные мышцы
МВ – сердечная мышца.
Диагностика инфаркта миокарда


Реакция образования креатинфосфата.


Энзимотерапия
Заместительная терапия
Элементы комплексной терапии.
Заболевания ЖКТ, тромбозы, онкология (аспарагиназа).


Специфические реактивы для определения ряда метаболитов.
Глюкозооксидаза применяется для количественного определения глюкозы с моче и крови.

Энзимопатии

Наследственные и приобретенные.
Нарушается метаболический путь, содержащий дефектный фермент.


К психиатру обратились два пациента, страдающие депрессивными расстройствами. Известно, что причиной возникновения депрессий у человека в ряде случаев является нехватка нейромедиаторов в синаптической щели. Также в мозге находятся ферменты группы моноаминооксидаз (МАО), которые разрушают медиаторы, выброшенные в синаптическую щель. Первому пациенту был назначен пирлиндол, который является структурным аналогом медиатора серотонина. Второму – ниаламид, который способен ковалентно связываться с активным центром МАО. Объясните механизм действия этих препаратов. Основываясь на механизме действия, объясните, какой из них будет иметь более длительное влияние на организм и почему.


Применение больших доз кофеина вызывает у людей симптомы, сходные с действием адреналина: увеличение частоты сердечных сокращений, расширение бронхов, возбуждение, изменение метаболизма в тканях и др.
Объясните механизм действия кофеина, имея в виду, что он является конкурентным ингибитором фермента фосфодиэстеразы, ответственного за распад цАМФ:
ФДЭ
цАМФ АМФ


Трипсиноген – протеолитический фермент, вырабатываемый в поджелудочной железе в неактивной форме, необходим для переваривания белков в кишечнике. Активация фермента происходит в 12-перстной кишке под действием энтеропептидазы, вырабатываемой эпителиальными клетками кишки, которая отщепляет гексапептид Вал-(Асп)4 – Лиз и образует активный трипсин. Каков механизм активации трипсина и обратима ли эта активация?