Гистохимические методы окраски, применяемые в практической гистологии

• Название: Гистохимические методы окраски, применяемые в практической гистологии
• Анкор: docsity-gistohimicheskie-metody-okraski
• Дата: 09.10.2022
• Размер: 278.12 Kb.
• Имя файла: docsity-gistohimicheskie-metody-okraski.pdf
• Тип: Диплом; #723222

гистохимические методы
окраски
Гистология
Дальневосточный государственный медицинский университет
(ДВГМУ)
18 pag.
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Министерство здравоохранения Хабаровского края
Краевое государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования
«
ИНСТИТУТ ПОВЫШЕНИЯ КВАЛИФИКАЦИИ СПЕЦИАЛИСТОВ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ»
Дипломная работа
«
Гистохимические методы окраски, применяемые в практической гистологии»
Выполнил слушатель:
Цикла « Гистология»
С «08» февраля 2017г. по «31» марта 2017 г.
Проверил : Бачалдин С.Л.
Хабаровск
2017
Содержание
1
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

1.
Введение………………………………………………………………..
2.
Организация и оснащение патогистологической лаборатории…...
3.
Требования к гистохимическим реактивам………………………….
4.
Красители и их применение………...………………………………...
5.
Список литературы……………………………………………………..
6.
Приложение……………………………………………………………..
Введение
2
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Гистология, наука, занимающаяся изучением тканей животных. Тканью называют группу клеток, сходных по форме, размерам и функциям и по продуктам своей жизнедеятельности. У всех растений и животных, за исключением самых примитивных, тело состоит из тканей, причем у высших растений и у высокоорганизованных животных ткани отличаются большим разнообразием структуры и сложностью своих продуктов; сочетаясь друг с другом, разные ткани образуют отдельные органы тела. История гистологии как отдельной ветви биологии тесно связана с созданием микроскопа и его совершенствованием.
М.Мальпиги
(1628–1694) называют
«
отцом микроскопической анатомии», а следовательно гистологии. Гистология обогащалась наблюдениями и методами исследования, проводившимися или создававшимися многими учеными, основные интересы которых лежали в области зоологии или медицины
Для современного этапа развития здравоохранения характерны:
•
возрастающий объем прижизненных морфологических исследований
(
биопсии, операционный материал, последы);
•
повышение роли в лечебно-диагностическом процессе прижизненных и посмертных (аутопсия) морфологических исследований.
До 80% рабочего времени (трудозатрат) современного патологоанатома занимает крайне ответственная и трудоёмкая диагностика болезней и патологических процессов по биоптатам, операционному материалу, материалу последов и цитологическим препаратам. В то же время сохраняется большое значение аутопсии (вскрытие трупа) как единственного и достоверного источника информации о причинах смертности населения, о качестве диагностики и лечения в лечебно-профилактических учреждениях
(
ЛПУ).
И прижизненный, и посмертный морфологический диагноз является наиболее точным из всех видов диагноза в медицине. Он решающим образом влияет на качество клинической диагностики и, в конечном счёте, имеет значительный экономический эффект. Поэтому морфологические методы исследования необходимо внедрять во все важнейшие целевые программы здравоохранения РФ.
3
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Доминирующая прижизненная микроскопическая диагностика во многих областях клинической медицины требует со стороны патологоанатомической службы (ПАС) Российской Федерации применения высокотехнологичных методик исследования
(
иммуноморфологические, молекулярно- биологические, цитогенетические, гистоавторадиографические и др. методики) и большого объёма врачебных знаний, как в области морфологии болезней, так и в области целого ряда смежных и клинических дисциплин.
Кроме того, она требует совершенствования существующей материально- технической базы ПАС РФ, на что следует обратить особое внимание.
ПАС обеспечивает население регионов Российской Федерации квалифицированной патоморфологической диагностикой и потому должна входить в территориальные программы обязательного медицинского страхования и медико-экономических стандартов.
Организация и оснащение патогистологической лаборатории
Гистологическая (патоморфологическая) лаборатория размещается в типовом или специально приспособленном помещении. Она должна быть оснащена необходимыми оборудованием, инструментами, лабораторной посудой и химическими реактивами.
4
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Рабочие помещения лаборатории — комната, в которой производят вырезку секционного, биопсийного или экспериментального материала; рабочая комната лаборантов; комната для размещения аппаратуры и моечная.
Рабочие помещения должны быть оснащены приточно-вытяжной вентиляцией.
В лаборатории необходимо строго соблюдать правила противопожарной безопасности и работы с летучими и токсичными веществами.
В рабочей комнате лаборанта должны быть вытяжной шкаф, химический и физический столы, шкаф и сейф для хранения химических реактивов.
Лабораторная мебель, выполненная из древесины, малопригодна для работы с многими токсичными веществами, используемыми в патоморфологии, поскольку затруднена ее последующая санитарная обработка, поэтому предпочтение следует отдавать специальной лабораторной мебели из металла и пластика, которая снабжена выдвижными частями, подводкой воды, вакуума, воздуха и газа. Рабочий стул должен иметь регулируемую высоту сиденья и спинки и легко перемещаться по полу.
Перечень необходимого оборудования лаборатории включает технические и аналитические весы, рН-метр, микротомы (санные, ротационные, замораживающие), криостат или криокит, водяную баню, столик для расплавления парафиновых срезов, комплекты автоматических пипеток, термостаты, холодильники, микроскопы, автоматы для проводки материала и др.
Бесперебойная работа любой гистологической лаборатории возможна лишь при наличии достаточного набора лабораторного стекла и посуды. Наиболее часто используют чашки Петри,
банки с притертыми пробками, бюксы, кюветы, химические стаканчики, предметные и покровные стекла.
Чашки Петри — плоские, широкие стеклянные чашки с крышками — используют для вырезки биопсийного материала, в них можно окрашивать
«
свободно плавающие» срезы, ставить гистоэнзиматические реакции в термостате и т.д.
Банки с притертыми пробками вместимостью 1 — 3 л чаще используют для приготовления музейных макропрепаратов, хранения и фиксации кусочков тканей, обезжиривания предметных стекол в смеси Никифорова или кислотах. Большие банки можно применять для хранения летучих веществ.
Банки вместимостью 50 — 200 мл чаще используют для хранения летучих химических реактивов, а также для подготовки кусочков тканей к заливке (в такой посуде проводят материал, полученный при гастро- и бронхобиопсии, а также пункционных биопсиях).
Бюксы стаканчики различной вместимости (чаще 10 — 100 мл) с притертой пробкой, которые используют для проведения гистологических окрасок и гистохимических реакций. Для постановки реакции на целлоидиновых и замороженных срезах применяют плоские бюксы диаметром около 50 мм.
Кюветы — прямоугольные стаканчики различной высоты с крышками — используют при проведении гистологических, гистохимических,
5
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

ферментохимических реакций для одновременной окраски нескольких срезов, наклеенных на предметные стекла.
Химические стаканчики вместимостью 50 — 100 мл используют для проведения гистохимических и ферментохимических реакций.
Предметные стекла размером 76 х 26 мм и толщиной 2 мм служат для приготовления гистологических препаратов.
Для проведения гистохимических, в том числе гистоэнзиматических, реакций желательно использовать стекла толщиной 1 мм.
Покровные стекла — тонкие и хрупкие стеклянные пластинки толщиной 0,15
— 0,2 мм. Чаще используют покровные стекла размером 18 х 18 и 24 х 24 мм.
В лаборатории должны быть также воронки разных размеров, фарфоровые стаканчики, ступки и мерная посуда (колбы, стаканы, цилиндры и мензурки).
Колбы из термостойкого стекла позволяют готовить реактивы, требующие нагревания. Большие колбы, как правило, служат для проточной и дистиллированной воды, а маленькие с притертыми пробками пригодны для хранения химических реактивов.
В патогистологических лабораториях применяют простые и градуированные пипетки. Вместимость последних составляет обычно от 0,1 до 100 мл; их используют при постановке гистохимических реакций и приготовлении реактивов.
Вся используемая лабораторная посуда должна быть снабжена этикетками и рационально размещена, что позволяет избежать ошибок при ее применении.
В набор используемых в гистологической лаборатории инструментов входят пинцеты
(
хирургические, анатомические и глазные), ножницы
(
анатомические, хирургические и глазные), скальпели, препаровальные иглы, шпатели — прямые и изогнутые металлические лопатки (чаще применяют при приготовлении срезов на замораживающем микротоме и целлоидиновых срезов), хирургические ножи для вырезки материала и ножи с двойным лезвием для получения тонких срезов ткани мозга. Для вырезки мелких объектов используют лезвия безопасной бритвы.
Требования к гистохимическим реактивам
Длительное время для изучения химического состава клеток и тканей пользовались классическими биохимическими методами. В основе которых лежит суммарное определение химических веществ в размельченной ткани, однако полного представления о локализации тех или иных химических веществ в различных структурных компонентах клеток и тканей не было.
Поиски методов с помощью которых стало возможным определять
6
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

локализацию химических веществ в целостных микроструктурах органов и тканей привели к созданию гистохимии. Различают качественную и количественную гистохимию. Качественная гистохимия отвечает на вопрос есть ли такни определенное вещество, а количественная –какое количество вещества содержится в единице объема или структуре.
К гистохимическим реактивам предъявляют следующие требования:
1.
они должны быть специфичными, то есть выявлять определенную группу веществ
2.
чувствительными, способными выявлять минимальные количества вещества
3.
одни химические группировки окрашиваются тем или иным красителем, так например фосфатные группы РНК образуют с основным красителем солеобразные окрашенные соединения
4.
в других случаях краситель растворяется в определенном субстрате, входящем в состав клеточных структур, например окраска жировых включений в клетке основана на растворении суданом в жировой клетке
5.
некоторые химические соединения клеток ДНК, полисахаридные не способны реагировать с красителями, тогда прибегают к превращению их химических группировок в реакционно-активные состояния
При этом освобождаются или создаются химические группировки которые могут реагировать с определенными реактивами, в результате чего образуется окрашенный продукт реакции.
Применение гистологических методик получило широкое распространение.
В настоящее время ни одна лаборатория не обходится без этих методов исследования тканей. Для того чтобы они были качественными, лаборант- гистолог должен владеть определенными навыками и соблюдать ряд условий, так как они основаны на определенных химических механизмах и обладают строгой специфичностью, поэтому особая точность и качество в работе просто необходимы.
Критериями оценки результатов гистологической реакции является не только локализация химических веществ, но и интенсивность окраски исследуемых компонентов клеток и тканей, так как именно она свидетельствует о концентрации выявленных веществ. Приемы, используемые для подготовки материала и проведения гистохимических реакций должны тщательно соблюдаться, так как отклонения на каком-либо этапе могут изменить ход
7
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

реакции и в итоге привести к неправильной оценке препарата. Для создания оптимальных условий протекания химических реакций особое внимание уделяется приготовлению рабочих растворов, чистоте применяемой посуды и стекол, качеству реактивов.
Буферные растворы применяются очень часто для гистохимических реакций, потому что химические процессы, протекающие в тканях организма, особенно с участием ферментов, требуют соблюдения ряда условий.
среди которых важное значение имеет pH среды. Как известно, степень кислотности данного раствора зависит от концентрации ионов Н+ , а степень его щелочности — от концентрации ионов ОН.
Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.
Буферные растворы могут храниться длительное время, но лучше использовать их свежими.
Красители их приготовление и применение
Парафиновые или целлоидин-парафиновые срезы перед окрашиванием освобождают от парафина с помощью любого его растворителя — бензола, толуола, ксилола, бензина. Особенно тщательно удаляют парафин перед исследованием ткани в поляризационном микроскопе, так как парафин обладает двоякопреломляющим свойством.
Депарафинирование осуществляют по следующей схеме:
Ксилол I
10-15 мин (можно в термостате при
37 °
С)
Ксилол II
3 — 5 мин
Спирт 100 % I
1-2 мин
8
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Спирт 100 % II
ополоснуть
Спирт 96 % I
оплоснуть
Спирт 96% II
ополоснуть
Дистиллированная вода
2 смены
После депарафинирования 100-150 препаратов реактивы нужно менять.
Депарафинированные препараты готовы к окрашиванию сразу же после промывания в дистиллированной воде, но во избежание отклеивания срезов, особенно при окраске по Ван-Гизону, их лучше подсушить на воздухе. Если окрашивание производят не сразу, то депарафинированные и высушенные препараты аккуратно, чтобы не повредить срезы, складывают в коробки и окрашивают по мере необходимости
Выявление ДНК по методу Фельгена
(
фиксаторы различные, но наилучшие Карнуа, Ценкера; заливка в парафин)
Сущность метода заключается в том, что продукты расщепления молекулы
ДНК, осуществляемого в слабокислой среде, взаимодействуя с бесцветной фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа), образует комплекс, обладающий пурпурной окраской. Таким образом, локализация продукта гистохимической реакции указывает местонахождение ДНК, а интенсивность окраски — ее концентрацию.
Реактив Шиффа. Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды и, периодически встряхивая сосуд с раствором, продолжают кипячение в течение 5 мин. Затем охладив содержимое до 50°С, раствор фильтруют, добавляют 20 мл 1N раствора НС1 и охлаждают до 25 °С, после чего добавляют 1 г метабисульфита натрия (Na2S2О 5 ) или калия
(K2S2O5 ) и оставляют в темноте. Через 18—24 ч в раствор всыпают 2 г активированного угля, встряхивают в течение 1 мин, отфильтровывают и хранят в темноте при 0—4°С. Готовый реактив Шиффа бесцветен или имеет светло-желтую окраску. Покраснение раствора в процессе хранения свидетельствует о его разложении и непригодности к употреблению.
Необходимо иметь в виду, что иногда в продажу поступает недостаточно очищенный основной фуксин. Поэтому если приготовленный раствор не отвечает предъявляемым требованиям, нужно взять основной фуксин из новой партии и вновь приготовить реактив.
Однонормальный раствор хлористоводородной кислоты (1N). К 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,19) добавляют 90 мл дистиллированной воды. Раствор может храниться длительное время.
Сернистокислая вода для промывки срезов. К 5 мл 10% бисульфита калия
(K2S2O5) добавляют 5 мл 1N раствора НС1 и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Раствор бисульфита калия можно применять в течение 7 дней, сернистокислую же воду готовят перед употреблением и применяют однократно. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
9
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

1.
Быстро ополоснуть в холодной IN НС1.
2.
Поместить в IN НС1 при 60°С на 6 мин (стаканчик ставят в водяную баню).
3.
Быстро ополоснуть в холодной IN НС1, а затем в дистиллированной воде.
4.
Поместить в реактив Шиффа на 40—60 мин.
5.
Осушить фильтровальной бумагой и ополоснуть в трех порциях свежеприготовленной сернистокислой воды по 1—2 мин в каждой.
6.
Промыть в водопроводной воде до 10 мин (если нужно докрасить цитоплазму: срез помещают на 1—1,5 мин в 1 % водный раствор светлого зеленого или 0,5% спиртовой раствор прочного зеленого).
7.
Обезводить, просветлить и заключить в бальзам. Результат. Участки ядер, содержащие ДНК, окрашиваются в красновато-пурпурный цвет
(
цитоплазма светло-зеленая).
Выявление гемоглобина (реакция Лепен)
Методика:
1.
Раствор бензидина и перекиси водорода 1-3 ми
2.
Спирт 50% - промыть
3.
Раствор железо-синеродистого калия 30-60 мин
4.
Дистиллированная вода –промыть
5.
Докрашивание ядер гематоксилином
6.
Дистиллированая вода
7.
Обезвоживание в спиртах, просветление в ксилоле, заключение в бальзам
Приготовление раствора бензидина и перекиси водорода: бензидин (взять на кончике ножа) растворить в 2 мл 96% спирта, добавить 0,5 мл перекиси водорода и 4,5 мл 70% спирта. Лучше пользоваться свежим раствором.
Приготовление раствора железо-синеродистого калия: 2% раствор железо- синеродистого калия смешать с 1% HCl в соотношении 1 : 1.
Результат реакции: гемоглобин – коричневый, гемосидерин – синий
Окрашивание жиров и липидов
Термин «липиды» собирательный, им обозначают все жироподобные вещества, экстрагируемые растворителями жиров (бензин, эфир, хлороформ)
В основе методов окраски лежат чисто физические процессы, суть их заключается в том, что вещества красящие жиры хорошо в них растворяются и поэтому легко переходят из раствора в липиды. Окрашивание суданом III –
является наиболее распространенным методом окрашивания жира.
10
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Методика: (жировой компонент и липиды выявляют только на замороженных срезах)
1.
Спирт 70% - промыть
2.
Судан III -30 мин
3.
Спирт 70% - промыть
4.
Дистиллированная вода – промыть
5.
Гематоксилин – 2 мин
6.
Водопроводная вода – промыть
7.
Солянокислая вода (дифференцировка – 3-5 сек)
8.
Водопроводная вода (аммиачная вода – 5-10 мин)
9.
Заключение срезов в глицерин – 5-10 мин
Приготовление солянокислой воды: 1 мл HCl и 100 мл дистиллированной оды. Приготовление аммиачной воды: в 100 мл дистиллированной воды растворить 5 кап аммиака. Приготовление судана III: 0,3 г судана III растворить в 100 мл 70% спирта, довести до кипения на водяной бане, охладить, профильтровать.
Результат реакции: при обработке суданом III жир принимает расный цвет.
Реакция на белок по Даниели
(
фиксаторы
Карнуа,Бродского,10% нейтральный формалин)
Сущность метода состоит в том, что гистологические препараты сначала подвергают действию трис-диазония розанилина (основного фуксина), который реагирует с многими аминокислотными остатками тканевых белков.
Для усиления окраски их обрабатывают Н-кислотой, которая соединяется с реакционноспособными группами трисдиазония, уже связанного с белками.
Интенсивность окраски определяется концентрацией белков в той или иной гистологическойструктуре.
Рабочие растворы: двунормальный (2N) раствор хлористоводородной кислоты. К 20мл концентрированной хлористоводородной кислоты
(
плотность 1,19) добавляют 80 мл дистиллированной воды.
Раствор основного фуксина. Растворяют 4 г основного фуксина (марка «для фуксинсернистой кислоты») в 100 мл 2N раствора хлористоводородной кислоты(раствор можно хранить длительное время).
Водный раствор нитрита натрия.
Растворяют 4 г нитрита натрия (NaО2) в 100 мл дистиллированной воды
(
раствор можно хранить в холодильнике).
Основной раствор трисдиазония. В пробирку наливают 2 мл раствора основного фуксина и затем по каплям при постоянном покачивании пробирки добавляют 2 мл раствора нитрата натрия. Смесь в течение 30-60 с приобретает соломенно-желтый цвет.
Рабочий раствор трис-диазония. Добавляют 0,5 мл основного раствора трис- диазония к 100 мл дистиллированной воды, предварительно забуференной добавлением 20 мл ацетатвероналового или другого буфера pH 7,9 (рабочий
11
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

раствор трис-диазония сохраняется в течение нескольких часов).
Насыщенный раствор Н-кислоты. Растворяют 1 г Н-кислоты в 50 мл ацетатвероналового или другого буфера pH 9,2.
Методика:
1.
Довести срезы до воды.
2.
Поместить в рабочий раствор трис-диазония на 10—20 мин (более точное время инкубации подбирают опытным путем).
3.
Промыть в дистиллированной воде.
4.
Промыть в трех сменах ацетатвероналового или другого буфера pH 9,2 по 2 мин в каждой.
5.
Перенести в насыщенный раствор Н-кислоты на 15 мин.
6.
Тщательно промыть в дистиллированной воде.
7.
Обезвредить, просветлить и заключить в бальзам. Результат.
Гистологические структуры окрашиваются в красно-фиолетовый цвет различной интенсивности.
Выявление гликогена и глиеопротеидов
В основе гистохимии веществ, содержащих полисахаридный компонент, лежит реакция шифф-йодная кислота
(
ШИК-реакция).
С помощью этой реакции можно выявить гликогены, мукопротеиды, гликопротеиды и гликолипиды.
Реактив Шиффа (способ приготовления см. выше — с. 270).
Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавить 4 мл концентрированной НС1. В 25 мл дистиллированной воды растворить 4 г безводного сульфита натрия. Оба раствора соединить.
Раствор перйодата. Растворить 1 г перйодата калия или 2,5 г перйодата натрия в
100 мл дистиллированной воды.
Метод
(
фиксаторы Шабадаша, спирт, формалин, жидкость Карнуа, жидкость
Ценкера; заливка в парафин, замороженные срезы).
1.
Срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
2.
Погрузить в раствор йодной кислоты на 5—10 мин или перйодата натрия либо калия на 20—30 мин.
3.
Тщательно промыть в двух—трех порциях дистиллированной воды (по
3—5 мин), чтобы удалить остаток йодной кислоты.
4.
Поместить в реактив Шиффа на 10—20 мин.
5.
Обработать в трех порциях свежеприготовленной сернистой воды (по 1
—2 мин).
6.
Промыть в водопроводной воде в течение 10 мин, ополоснуть в дистиллированной.
12
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

7.
Обезводить, просветлить и заключить в бальзам (если нужно окрасить ядра, то после шестого этапа производят докрашивание срезов гематоксилином).
Результат. Вещество полисахаридной природы окрашено в пурпурно- или лилово-красный цвет. Нейтральные мукополисахариды бывают обычно пурпурно-красными, гликоген
— более темный.
Примечание. Обработку реактивом Шиффа следует проводить в хорошо закрывающихся биологических стаканчиках, обернутых в черную бумагу.
Одну порцию реактива можно применять многократно (до появления красноватой окраски).
Если на срезах появляются грязно-коричневые пятна, это свидетельствует о том, что окисляющий раствор не был полностью промыт перед обработкой срезов реактивом Шиффа.
Дифференцировка веществ, дающих ШИК-положительную реакцию
ШИК-положительную реакцию, помимо гликогена, дает группа веществ полисахаридной природы —гликолипиды, гликопротеиды, мукопротеиды, а также некоторые вещества, не содержащие углеводов: фосфолипиды, липопротеиды и некоторые липиды. Поэтому, для того чтобы определить, какое из веществ присутствует в исследуемых тканях в каждом конкретном случае, необходимо провести дополнительные реакции для уточнения ШИК- положительных веществ.
Расщепление гликогена. Применяют готовый препарат диастазу или фермент, содержащийся в слюне.
В первом случае к 0,1% 0,02М раствору диастазы в фосфатном буфере с pH
6,0 добавляют хлорид натрия (поваренная соль) до концентрации 0,8%, во втором собирают несколько кубиков слюны и отфильтровывают в стаканчик.
Метод. 1. После депарафинирования и доведения до воды один—два среза помещают в раствор диастазы (или слюны) и ставят в термостат при 37°С на
30—60 мин, остальные оставляют в воде.
1.
Промывают срезы в дистиллированной воде вместе с остальными срезами (необработанными ферментами) и подвергают ШИК-реакции по описанному методу.
Результат. 1. Отсутствие окраски в срезах, инкубированных в растворе, содержащем фермент (контрольные), свидетельствует о том, что ШИК- положительная реакция в остальных срезах обусловлена наличием в тканях гликогена; 2) если все срезы окрашены одинаково, это значит, что гликоген отсутствует и окраска обусловлена другими веществами, дающими ШИК- положительную реакцию; 3) если контрольные срезы окрашены менее интенсивно, чем остальные, следует считать, что часть ШИК-положительного материала составляет гликоген.
Реакция ацетилирования. Контрольные срезы обрабатывают в течение 1—24 ч при 21° С в смеси мл уксусного ангидрида и 24 мл сухого пиридина, промывают водой, обрабатывают в течение 1 ч в растворе гидроксида натрия
(0,4 мл NaOH на 100 мл дистиллированной воды), промывают в воде и проводят ШИК-реакцию. Отрицательные результаты указывают на то, что
13
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

первоначальная реакция была обусловлена присутствием углеводных веществ (1—2 гликолевые группы).
Экстракция липидов. Срезы выдерживают в тление 29 ч в смеси из разных частей хлороформа и метанола при 58°С. Если при ШИК-реакции окраска исчезает или уменьшается, то она была обусловлена липидными веществами.
Реакция — шифф-надуксусная кислота. Срезы, предварительно обработанные 1—2 ч в растворе надмуравьиной или надуксусной кислоты, затем окрашивают реактивом Шиффа. Наличие в них структур, окрашенных в красный цвет, указывает на содержание липидов с ненасыщенными связями
(
фосфолипиды или цереброзиды).
Обработка срезов трипсином. Если в предварительно обработанных трипсином срезах исчезает или уменьшается ШИК-положительная реакция, то она была обусловлена белковыми веществами.
Выявление железа методом с образованием турнбулевого синего
Железо может находиться в тканях как в свободном виде (неорганическое), так и в химической связи с молекулами органических веществ (гемоглобин эритроцитов). Гистохимическое исследование тканей на содержание железа производят при изучении пигментного обмена, особенно при заболеваниях, связанных с гемолитическими процессами в крови.
Метод основан на химической реакции между сульфидом железа и гексациано-ферратом калия, в результате которой образуется турнбулевый синий.
Реакция специфична, надежна, препараты стойкие.
Метод (фиксация формалином, абсолютным спиртом, срезы замороженные, парафиновые, целлоидиновые).
1.
Поместить срезы из дистиллированной воды в 10% раствор сульфида аммония на 1—24 ч.
2.
Тщательно отмыть в нескольких порциях дистиллированной воды.
3.
Поместить в свежеприготовленную смесь из равных частей 20% раствора гексациано-феррата
(3) калия и
1% раствора хлористоводородной кислоты на 10—20 мин.
4.
Тщательно ополоснуть в дистиллированной воде.
5.
Подкрасить ядра кармином.
6.
Промыть, обезводить, просветлить, заключить в бальзам.
Результат: участки, содержащие железо, окрашены в интенсивно-синий цвет, ядра красные.
Примечание. Необходимо исключить применение в процессе работы металлических предметов. Посуду следует тщательно промыть слабой хлористоводородной кислотой, а затем дистиллированной водой, полученной из стеклянного аппарата (чтобы исключить следы металла). Раствор сульфида аммония должен иметь чистый желтый цвет и сохраняться не дольше 2—3 нед в хорошо закрывающейся посуде. При доступе воздуха появляется
14
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

коричнево-желтое окрашивание, свидетельствующее об инактивации раствора.
Выявление слизи муцикармином
Методика:
1.
Гематоксилин – 5 мин
2.
Дистиллированная вода – промыть
3.
Муцикармин – 10-12 мин
4.
Дистиллированная вода – промыть
5.
Обезвоживание в спиртах, просветление в ксилоле, заключение в бальзам
Приготовление муцикармина: 1г кармина и 0,5г хлористого алюминия растирают в фарфоровой чашке, добавляют 2 мл дистиллированной воды,
нагревают, помешивая на маленьком пламени горелки, пока не получится темно-красная вязкая масса (2 мин). При постоянном помешивании к горячей массе постепенно приливают 10 мл 50% спирта. Через сутки краску фильтруют. Профильтрованный раствор имеет темно-красный цвет. Краска должна окрашивать только слизь. Если же ею окрашиваются и ядра, то в нее по каплям добавляют 1% раствор соды. При наличии готового муциармина его разводят из расчета 1,5г порошка на 100 мл 50% спирта. Перед употреблением спиртовый раствор муцикармина разводят водопроводной водой в 5 раз.
Результат реакции: слизь окрашивается в красный цвет, ядра –в синий.
Выявление кальция (метода Коса)
Метод позволяет выявить прежде всего отложения фосфорнокислой извести.
Кусочки лучше всего фиксировать в крепком спирте, так как формалин может вымывать известь.
Методика:
1.
Дистиллированная вода – промыть
2.
3-5% раствор азотнокислого серебра -10-60 мин
3.
Дистиллированная вода – промыть
4.
5% гипосульфата – 2-3 мин
5.
Водопроводная вода –промыть
6.
Докрашивание ядер гематоксилином – 1мин
7.
Дистиллированная вода – промыть
8.
Обезвоживание в спиртах, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
Результат реакции: известковые отложения принимают черный цвет
Реакция на амилоидоз с Конго-красным
15
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Методика:
1.
Срезы депарафинируют
2.
1% водный раствор конго-красного – 1-3 мин
3.
Водопроводная вода – промыть
4.
Спирт 80% - пока срезы не станут бледно-розовыми
5.
Водопроводная вода – 2 мин
6.
Подкрашивание гематоксилином – 1 мин
7.
Водопроводная вода – 3 мин
8.
Дистиллированная вода
9.
Обезвоживание в спиртах, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
При перекрашивании в гематоксилине, можно дифференцировать 1% водным раствором соляной кислоты.
Результат реакции: амилоид окрашивается в красный цвет.
«
Железный» метод выявления меланина по Лилли
1.
Материал фиксируют в различных смесях, заливают в парафин.
2.
Депарафинированные срезы доводят до воды.
3.
Помещают в 2,5 % раствор сульфата железа гептагидрата на 60 мин.
4.
Промывают в 4 сменах дистиллированной воды по 5 мин.
5.
Помещают в 1 % раствор гексацианоферрита (III) калия в 1 % уксусной кислоте на 30 мин.
6.
Промывают в 1 % уксусной кислоте.
7.
При желании докрашивают пикрофуксином по Ван-Гизону.
8.
Проводят через спирт возрастающей концентрации и ксилол, заключают в бальзам.
Результат:
меланин окрашивается в темно-зеленый цвет на бесцветном фоне; такой же цвет имеет гемосидерин.
Меланин, как и липофусцин, обладает способностью восстанавливать раствор аммиачного серебра. На этом основан принцип электронно- микроскопического гистохимического выявления промеланосом и меланосом по Мисиме. Раздельное выявление меланина и липофусцина возможно по их
16
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

разному окрашиванию нильским синим. Кроме того, липофусцин в отличие от меланина дает видимую собственную флюоресценцию в ультрафиолетовом свете.
Заключение
Развитие медицины формируют определенные требования к патогистологической службе, что связано с изменением характера и структуры исследуемого материала, с увеличением объема исследуемых биоптатов и удаленных при операциях органов и тканей, с необходимостью улучшения качества морфологической диагностики на базе использования новинок и даже зарекомендовавшими себе методами. В настоящее время от патологоанатома, врача-гистолога во многом зависит лечебная тактика и как следствие судьба больного. Применение гистохимических методик при исследовании биоптатов помогает с решением задач связанных с дифференциальной диагностики ранних и пограничных форм злокачественных новообразований, оценки интенсивности дистрофических, воспалительных и других патологических процессов, что позволяет повысить точность, надежность и достоверность диагноза. В связи с этим необходим постоянный профессиональный рост, совершенствование теоретической базы и практического мастерства врачей и лаборантов-гистологов.
17
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])

Список использованной литературы
1.
«
Гистологические и гистохимические методы» - Шереметьева Г.Ф.
2.
Руководство «Микроскопическая техника» - Лацман М.Н.
3.
«
Курс патогистологической техники» - Меркулов Г.А.
4.
«
Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии» - Угрюмов
М.В.
5.
«
Основы гистологии с гистологической техникой» - Волкова О.В.,
Елецкий Ю.К.
18
Document shared on www.docsity.com
Downloaded by: parseghi ([e-mail])