Биосинтез аминокислот. Использование мутантов микроорганизмов
![]()
|
Содержание
Введение Аминокислоты - это органические кислоты, содержащие одну или несколько аминогрупп, с биологической - важнейшие азотсодержащие вещества в живой клетке. К настоящему времени в природе обнаружено более 300 аминокислот (к началу века их было открыто 17, к середине - 60, а к 1965 году уже больше 170). Все -аминокислоты (кроме глицина) имеют асимметрический -углеродный атом и существуют в двух зеркальных изомерных формах, называемых энантиомерами , L- и D-конфигурации. Энантиомеры обладают одинаковыми химическими свойствами. Их химический синтез завершается обычно получением D,L-изомеров, которые достаточно сложно разделить на индивидуальные изомеры химическим путем, что необходимо для дальнейшего использования аминокислот, поскольку все молекулы белков организма состоят из L- изомеров. Поэтому целесообразней использовать при производстве аминокислот биологический синтез, при котором используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. В настоящее время больше всего разработок посвящено получению лизина (продуценты Brevibacterium lactofermentum и бактерии рода Corynebacterium), также предложены способы биотехнологического получения изолейцина, треонина (при использовании E. coli). Большинство исследованных штаммов микроорганизмов независимо от их систематического положения преимущественно накапливают α-аланин и глутаминовую кислоту. Значительно меньше штаммов и в меньшем количестве выделяют аспарагиновую кислоту, лейцин, валин, изолейцин, лизин. Использование мутантов микроорганизмов Обычные микроорганизмы не способны синтезировать необходимые аминокислоты в нужном количестве, поэтому работы по микробному синтезу аминокислот состояли в прямой селекции штаммов микроорганизмов, способных накапливать аминокислоты в значительных количестве при росте на средах с большим количеством углерода и меньшим количеством углерода. В этом случае аминокислоты накапливаются в результате нарушения равновесия между углеродным и метаболизмом и ассимиляцией азота. Впоследствии были использованы мутанты микроорганизмов. Многие из них продуцируют одни аминокислоты, но являются дефицитными по другим аминокислотам и витаминам. Для получения мутантов микроорганизмов используют химические и физические мутагены. К химическим мутагенам относятся этиленамин, новоэмбихин, диэтилсульфат, радиоактивные изотопы, тяжелый водород, сильные окислители (HNO3, KmnO4); к физическим – рентгеновские лучи, ультрафиолетовые лучи, температурное воздействие. Для получения любой аминокислоты путем микробного синтеза необходимо, чтобы выбранный микроорганизм обладал таким обменом веществ, который обеспечивал бы эффективное превращение источника углерода в одну аминокислоту. Обычно такая особенность микроорганизма настолько неблагоприятна для его выживания, что спонтанно возникающие в природных условиях мутанты неизбежно должны отсеяться в процессе естественного отбора. Поиски подходящих микроорганизмов идут по двум основным линиям. Во-первых, микроорганизмы разных видов – дрожжи, бактерии, грибы – проверяют на их способность накапливать желаемую аминокислоту в культуральной жидкости. Во-вторых, наиболее активные штаммы пытаются затем улучшить, применяя различные мутагенные факторы. В группу мутантов микроорганизмов с измененными биологическими свойствами входят ауксотрофные мутанты и продуценты биологически активных веществ. Ауксотрофными мутантами называют мутанты, потерявшие способность в связи с нарушением нормальных биосинтетических процессов самостоятельно синтезировать те или иные аминокислоты, пурины, пиримидины, витамины. Дефицитность ауксотрофных мутантов по определенным веществам связана с нарушением нормального хода биосинтетических реакций и блокированием отдельных этапов синтеза. В результате блокирования получение конечных продуктов становится невозможным и происходит накопление веществ, получаемых в реакциях, предшествующих блоку. Ауксотрофные мутанты являются патологическими формами, неспособными существовать в обычных условиях, поэтому их культивирование требует поддержания особых условий. Промышленный синтез аминокислот. Способность микроорганизмов выделять в культуральную жидкость продукты обмена, в том числе и аминокислоты, известна с конца прошлого столетия, однако интенсивное изучение внеклеточного накопления аминокислот микроорганизмами, как указывалось выше, началось в 60-е годы нашего века. Состав аминокислот, накапливаемых различными микроорганизмами в средах, довольно однообразен. Это — глутаминовая и аспарагиновая кислоты, аланин, лейцин, изолейцин, глицин, серин, фенилаланин, лизин. Чаще всего встречаются продуценты глутаминовой кислоты и аланина. Свежевыделенные из естественных субстратов штаммы микроорганизмов чаще всего выделяют аланин и глутаминовую кислоту. ли гл кислоту и аланин, из 310 аШтаммы, образующие лизин, встречаются редко, триптофан — еще реже. Возможны три способа промышленного получения незаменимых аминокислот: гидролиз белков растительного и микробного происхождения, микробиологический и химический синтез. Более 60% всех производимых промышленностью чистых препаратов аминокислот получают путем микробиологического синтеза. На втором месте по объему производства находится химический синтез. Основным недостатком химического синтеза является получение смеси аминокислот, состоящих из изомеров D- и L-ряда, тогда как биологической активностью в организме человека и животных обладают лишь L-изомеры. D-изомеры аминокислот не перерабатываются их ферментными системами, а некоторые из них токсичны. Исключением является аминокислота метионин, у которой биологически активными является и D- и L- изомеры, поэтому данную аминокислоту производят преимущественно путем химического синтеза. Технологии получения аминокислот за счет гидролиза белков экономически менее выгодны, поэтому не получили широкого распространения. При микробиологическом синтезе образуются L-аминокислоты, являющиеся продуктами жизнедеятельности специально подобранных и отселектированных штаммов микроорганизмов, которые способны накапливать в культуральной жидкости не менее 60 г/л синтезируемой аминокислоты. Чаще всего для микробиологического синтеза аминокислот используют ауксотофные мутантные штаммы, которые получают методами обычной селекции и генной инженерии. С помощью мутагенных факторов у таких ауксотрофных штаммов индуцируется мутация, в результате которой прекращается или ингибируется синтез одного из продуктов, оказывающих регуляторное влияние на ферментные системы, катализирующие образование данной аминокислоты в клетках мутанта и в культуральной жидкости повышается. На основе культивирования микроорганизмов с целью получения чистых препаратов аминокислот применяют промышленные технологии, включающие одно- и двухступенчатый синтез аминокислот. При одноступенчатом синтезе в промышленных культиваторах выращивают ауксотрофные регуляторные мутанты, являющиеся сверхпродуцентами тех или иных аминокислот. После завершения рабочего цикла их выращивания культуральную жидкость отделяют от клеток микроорганизмов, сгущают и получают из нее товарной продукт с высокой концентрацией синтезированной микробами аминокислоты. В процессе двухступенчатого синтеза аминокислоты вначале получают ее предшественник, а затем с помощью ферментов микроорганизмов превращают предшественника в аминокислоту, при этом образуются только L- изомеры. В качестве источника фермента могут быть использованы либо суспензия клеток микроорганизмов, либо полученный после разрушения этих клеток ферментный раствор. Микробиологический синтез глутаминовой кислоты. Глутаминовая кислота в значительных количествах присутствует в микробных клетках и принимает участие в образовании различных продуктов их метаболизма. Глутамат натрия широко используют в качестве приправы к пище, а глутаминовую кислоту применяют для лечения трофических нарушений обмена веществ. Для производства L-глутомата используют культуры Brevibacterium. Оптимальным является использование среды, содержащей 10% глюкозы, накоплению L-глутомата способствуют энергичная аэрация и перемешивание, средняя температура инкубации 300, рН 6,0 – 8,0. В культуральную жидкость периодически добавляют мочевину. В качестве источников сахара используют сырой гидролизат древесины и мелассу. Все бактерии нуждаются в биотине как факторе роста и выход L-глутомата в их культурах зависит от концентрации биотина в среде. Схема биосинтеза L-глутомата ![]() Глутаминовая кислота играет весьма важную роль в обмене веществ организмов, так как лежит на путях синтеза различных соединений. Микробиологический синтез лизина, метионина, треонина и изолейцина. Белки зерна, пшеницы, ячменя, кукурузы и других злаковых культур не сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот и, прежде всего, лизина. Поэтому для удовлетворения потребностей животноводства в лизине в нашей стране и ряде других стран организовано его крупномасштабное производство. В основу производства положены технологии с использованием одноступенчатого микробиологического синтеза, которые включают промышленное культивирование ауксотрофных мутантов бактерий из рода Corynebacterium, способных к сверхсинтезу этой аминокислоты. Обычно у диких штаммов, из которых получены ауксотрофные мутанты, сверхсинтеза лизина не наблюдается, так как у них действуют механизмы саморегуляции. В клетках бактерий аминокислота лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты через ряд промежуточных этапов, связанных с образованием полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидропиколиновой кислоты и α,ε-диаминопимелиновой кислоты, являющейся непосредственным предшественником лизина. Полуальдегид аспарагиновой кислоты является также одним из предшественников в синтезе аминокислот – треонина, метионина и изолейцина (схема 1). Процесс синтеза аминокислот (лизина, треонина, метионина и изолейцина) начинается фосфорилированием аспарагиновой кислоты с участием аллостерического фермента аспартаткиназы, активность которого ингибируется совместным действием двух аминокислот – лизина и треонина, если они накапливаются в клетках бактерий в избыточной концентрации. Если понизить концентрацию одной из этих аминокислот, то синтез другой будет осуществляться даже при условии, когда она накапливается в довольно высокой концентрации. Лизин Изолейцин ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Микробиологический синтез триптофана. Наряду с лизином разработаны промышленные технологии получения кормовых и высокоочищенных препаратов другой незаменимой аминокислоты – триптофана. Для производства этой аминокислоты применяют как одноступенчатый синтез с помощью бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией синтеза аминокислот, так и двухступенчатый синтез, включающий вначале получения предшественника триптофана, а затем его ферментативное превращение в конечный продукт – триптофан. У бактерий и многих других организмов аминокислота триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпировиноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана в процессе его синтеза является антраниловая кислота. Синтез триптофана аллостерически ингибируется конечными продуктами, которые действуют на ферменты, катализирующие начальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой кислоты. Для смещения метаболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую( схема 2). Это достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается повышенный синтез аминокислоты триптофана, однако для нормального развития этих мутантов в питательную среду необходимо добавлять дефицитные аминокислоты – фенилаланил и тирозин – в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана. Для промышленного получения триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов бактерий Basccillus sibtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина. Схема 2 ![]() Фосфопируват 5-дигидрохинная кислота Шикимовая кислота Хоризмовая кислота Префеновая кислота Фенилпировиноградная кислота Фенилаланин Эритрозо-4-фосфат Антраниловая кислота n-оксифенилпирови-ноградная кислота Тирозин Триптофан ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() Заключение В настоящее время в животноводстве стоит проблема балансирования кормовых рационов по полноценному протеину. Натуральные корма, используемые в животноводстве, имеют не оптимальный аминокислотный состав. Для доведения концентрации аминокислот в кормовом рационе до оптимума требуется добавление препаратов чистых аминокислот, особенно незаменимых, полученных промышленным способом. В мире ежегодно производится не менее 300 тыс.т. кормовых препаратов незаменимых аминокислот. В пищевой промышленности также используются аминокислоты, полученные путем микробиологического синтеза, например, глутаминовая кислота. Некоторые аминокислоты, например метионин, используются в фармацевтической промышленности для производства диетических пищевых добавок. Метионин в последнее время применяется в качестве подкормке в птицеводстве. Список используемой литературы
|