получение антибиотиков. РЕФЕРАТ. Получение антибиотиков (виды, продуценты антибиотиков)
 Скачать 41.63 Kb.
|
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииКафедра фармацевтической технологии с курсом биотехнологийПрезентация на тему :ПОЛУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ (виды, продуценты антибиотиков)Выполнила : Студентка 52 гр Института Фармации Грачёва Е.С Проверил: Доктор фармацевтических наук, профессор Первушкин С.Г Самара, 2022г. ОглавлениеВведение 4 1. Теоретические сведения о технологии получения антибиотиков 6 1.1 Понятие и процесс производства антибиотиков 6 1.2 Стерилизация питательных сред 9 1.3 Подготовка посевного материала 11 1.4 Методы культивирования продуцентов антибиотиков 11 1.5 Ферментеры 12 1.6 Развитие продуцента антибиотика в ферментере 14 1.7 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотиков 15 1.8 Сушка, контроль и расфасовка препарата 18 2. Применение антибиотиков в современных условиях 20 Заключение 21 ВведениеАнтибиотики - самый большой класс фармацевтических препаратов, которые синтезируются микроорганизмами. Некоторые из антибиотиков используют в сельском хозяйстве против различных сельскохозяйственных вредителей, другие - в медицинских целях. В настоящее время микроорганизмы продуцируют десятки видов соединений - аминокислот, антибиотиков, белков, витаминов, липидов, Микробиологический синтез различных веществ играет ключевую роль в биотехнологическом производстве. Начало современной промышленной микробиологии было положено в 40-х годах, когда наладили производство пенпциллинов методами ферментациинуклеиновых кислот, полисахаридов, пигментов, сахаров, ферментов и т. д. После установления высоких лечебных свойств первого антибиотика — пенициллина сразу же возникла задача организации производства его в больших количествах. На первом этапе промышленное получение этого препарата носило примитивный, экономически нерентабельный характер. Выращивание продуцента антибиотика осуществлялось на средах, находящихся в небольших сосудах при поверхностном культивировании гриба. Процесс развития гриба продолжался 8—10 суток. Такой способ культивирования гриба при большой затрате труда давал низкий выход антибиотика, и себестоимость препарата была очень высокой. Безусловно, такое получение антибиотика не могло удовлетворить запросы медицины. В результате был предложен метод глубинного выращивания гриба в ферментерах или танках — при продувании воздуха и перемешивании культуральной жидкости. [1] Из данного примера можно сделать вывод, что биотехнология антибиотиков весьма сложное, но в тоже время необходимое производство. Технологию получения антибиотиков нужно совершенствовать, а совершенствование невозможно без изучения основных стадий получения антибиотиков, а также анализа всех процессов, происходящих на них. 1. Теоретические сведения о технологии получения антибиотиков1.1 Понятие и процесс производства антибиотиковУспехи антибиотической отрасли промышленности и качество выпускаемой продукции определяются уровнем основных стадий технологического процесса. Промышленное получение антибиотиков — это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий. 1) Стадия биосинтеза антибиотика. Это основная биологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии — создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика. Высокая результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента антибиотика, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма, в том числе стоимости применяемых предшественников, а также общих энергетических затрат на процессы, связанные с развитием продуцента антибиотического вещества. антибиотик ферментер посевной 2) Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации. Эффективность стадии во многом определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, местом основного накопления биологически активного вещества (в культуральной жидкости или внутриклеточно). 3) Стадия выделения и очистки антибиотика. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного места накопления антибиотического вещества применяются различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используются следующие: экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка. Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первом этапе работы приходится иметь дело с небольшой концентрацией (не более 1%) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах концентрация антибиотического вещества увеличивается до 20—30%. Все это требует применения различных емкостей и различных объемов используемых реагентов. 4) Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка. Особенность стадии определяется очень высокими требованиями к качеству конечного продукта. При химической очистке антибиотических веществ необходимо соблюдать высокую чистоту помещений, оборудования, проводить систематическую дезинфекцию их. В случае выпуска антибиотиков, предназначенных для инъекций, препараты должны быть стерильными: получение таких антибиотических препаратов, приготовление различных лекарственных форм, дозировка и упаковка должны осуществляться в асептических условиях. В современных условиях производства антибиотиков необходимо принимать меры к максимальному снижению себестоимости препаратов. Для этого необходимо: 1) внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов — продуцентов антибиотиков; 2) создание и обеспечение самых благоприятных условий развития продуцента антибиотика на относительно дешевых средах; 3) широкое использование математических методов планирования процесса развития организма и электронно-вычислительной техники с целью оптимизации и моделирования условий его культивирования, обеспечивающих максимальный выход антибиотика; Применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с автоматизированными контролирующими устройствами основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика. [3] 1.2 Стерилизация питательных средДля каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда. В зависимости от природы используемого микроорганизма в качестве источника углерода возможно применение различных субстратов. Например, для получения пенициллина лучшим источником углерода и энергии является глюкоза и лактоза; грамицидина – глицерин и соли янтарной кислоты; стрептомицина и неомицина – глюкоза. [2] Среда должна соответствовать определенным требованиям: 1) обеспечивать максимальное образование антибиотика; 2) состоять из относительно дешевых компонентов; 3) иметь хорошую фильтрующую способность; 4) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков. Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным. Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до определенной температуры (120—130°С) непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30—60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27—30°С. За время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, происходит разрушение значительного числа микроорганизмов. Хорошо известно, что для нагревания до температуры стерилизации больших объемов среды и затем ее охлаждения требуется больше времени, чем для маленьких объемов, а поэтому время, затрачиваемое на поддержание наиболее высокой стерилизующей температуры в больших объемах, может быть меньшим, чем для небольших объемов с тем же эффектом стерилизации. Наилучший эффект стерилизации и сохранения термолабильных веществ среды получается в том случае, если стерилизация проводится при более высокой температуре и за более короткое время. Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонку, через которую пропускается острый пар. Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и происходит быстрый ее нагрев. Среда в колонку подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы. Среда, нагретая в колонке до температуры около 130°, поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125—130°С. Время выдержки зависит от состава среды и составляет 5—10 минут. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30—35°С (на выходе) и поступает в ферментер. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим: 1) при непрерывном методе стерилизации каждый элементарный объем среды находится при высокой температуре короткое время; 2) благодаря более высоким температурам стерилизации и короткой экспозиции деструкция компонентов питательной среды минимальна; 3) процесс стерилизации всего объема питательной среды растянут во времени, этим обеспечивается более равномерная разгрузка котельной; 4) процесс легко контролируем и управляем. При применении в качестве отдельных компонентов субстрата термолабильных веществ их, как правило, следует стерилизовать отдельно в условиях более мягкого режима. [4] 1.3 Подготовка посевного материалаПодготовка посевного материала — одна из ответственнейших операций в цикле биотехнологического метода получения антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментере, так и биосинтез антибиотика. Продуцент антибиотика обычно выращивается на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала — процесс многоступенчатый. Микроорганизм предварительно выращивают на агаризированной среде в пробирке, затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2—3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой инокулятор, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор, откуда и производят посев в основном ферментере. Для посева в основной ферментер используют от 5 до 10 объемных процентов посевного материала (инокулята). Однако в случае получения пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях, рисовых зернах или пшене, засевают сразу в инокулятор. [3] 1.4 Методы культивирования продуцентов антибиотиковВ современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается. Можно указать четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов. 1) Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется. 2) Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня. 3) Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго — в третий. Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов происходит более рациональное использование емкостей. 4) Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков. В основе этого метода лежит то, что развитие микроорганизма происходит в условиях непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. [5] 1.5 ФерментерыДля изучения условий образования антибиотиков и производства этих биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются ферментеры — специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов антибиотиков. Ферментер — это довольно сложный аппарат, в котором создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза им антибиотика. В этих целях ферментер снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами. Обеспечение культур микроорганизмов кислородом осуществляется в основном следующими способами: пропусканием воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием; встряхиванием культуральной среды, находящейся в колбах, на специальных качалках; выращиванием микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды. [6] Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого-биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения. Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб. В современных ферментерах контрольно-измерительная аппаратура соединена с электронно-вычислительной машиной, что позволяет автоматически контролировать весь биосинтетический процесс по заданной программе. В зависимости от характера проводимых работ используются различного типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные, производственные. Лабораторные ферментеры изготовляются из стекла или нержавеющей стали и имеют, как правило, емкость не более 30 л. Обычно стерилизацию таких ферментеров производят в автоклавах. Питательную среду, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер. Полупроизводственные ферментеры имеют емкость 100 л, выполнены из нержавеющей стали. Производственные ферментеры. В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости — от 500 л до 50 и 100 м3. Стерилизация полупроизводственных и производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций осуществляется перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется путем фильтрации через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем. Использование волокнистых фильтров — широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха, причем, чем меньший диаметр имеют волокна материала, тем лучше их фильтрующая способность. [3] 1.6 Развитие продуцента антибиотика в ферментереПроцесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех его стадий, очень точно выполняется разработанный регламент условий развития организма — продуцента антибиотика. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды, степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляется биологический контроль, учитывается потребление организмом основных питательных компонентов субстрата: источников углерода, азота, фосфора; внимательно следят за образованием антибиотика. Существенное внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента антибиотика в ферментере. Основная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментерах при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла, животный жир, а иногда минеральные масла, спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества. Многие вещества (масла, жиры, спирты), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. [7] 1.7 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотиковВ процессе развития микроорганизмов образуемые ими антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость выделяется лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма. В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Выделение антибиотика из клеток микроорганизмов осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями. В случае если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют. Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. Для процесса фильтрации применяют фильтрующие аппараты: фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги, сепараторы. Фильтр-прессы применяются для обработки больших объемов культуральной жидкости. Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Широкое распространение в получении жидкости, освобожденной от взвешенных частиц, получил способ центрифугирования. Отделение мицелия или других взвешенных частиц можно также производить в сепараторах. Цель химической очистки — извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответствующего применения. Антибиотические вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенной температуры, высокой кислотности или щелочности и др.) в ряде случаев теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности. Основными методами очистки антибиотиков являются следующие. Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации. Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда их ионов называют катионитами или анионитами. Антибиотик (как отрицательно заряженный ион) будет сорбироваться на катионитной смоле и наоборот. Адсорбированный на смоле антибиотик десорбируют, в результате чего получают значительно очищенный и концентрированный препарат. Затем раствор этого препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом на смоле осядут примеси, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку. Метод осаждения. Антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью получения соединения, выпадающего в осадок; последний с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают. Образовавшееся соединение растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают. Одна из стадий химической очистки антибиотиков — концентрирование полученных растворов; достигается отгонкой большей части растворителя, как правило, в высоком вакууме. Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение, прежде всего для улучшения качества получаемого антибиотика и увеличения выхода препарата. [3] 1.8 Сушка, контроль и расфасовка препаратаПосле выделения и химической очистки антибиотика необходимо удалить из полученного препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют методы обезвоживания препаратов. Лиофильная сушка антибиотиков — широко распространенный прием; проводится при сравнительно низких температурах (—8, —12°С). Высушивание с применением распылительной сушилки — прогрессивный метод при работе с большими количествами антибиотика; раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков протекает в течение нескольких секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют свойств. Метод взвешенного слоя или сушка в вакуум-сушильных шкафах применяется для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому. Биологический контроль ставит задачей выяснение стерильности готового препарата. Для этого используют, как правило, два метода. Первый — связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соответствующую питательную среду. Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяется тем, что для большинства этих соединений не имеется биологических инактиваторов их биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выявляют наличие устойчивых к ним форм микроорганизмов, а также определяют возможное присутствие чувствительной микрофлоры. Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и на другие жизненно важные функции организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности. Показатели острой токсичности являются одним из критериев качества антибиотического вещества. Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению. Расфасовка и упаковка антибиотика — следующий этап работы. Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу. [3] 2. Применение антибиотиков в современных условияхАнтибиотики широко применяются в различных сферах человеческой деятельности: медицине, пищевой и консервной промышленности, сельском хозяйстве. Открытие антибиотиков вызвало переворот в медицине. Широко известно применение антибиотиков с бактерицидным и бактериостатическим действием; благодаря антибиотикам стали излечимыми многие инфекционные заболевания (чума, туберкулез, пневмония, брюшной тиф, холера). В течение многих лет антибиотики применяют в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных, средств борьбы с болезнями животных и растений. Антибиотические вещества также широко применяют для борьбы с посторонней микрофлорой в ряде бродильных производств и в консервной промышленности. Однако нельзя не отметить, что длительное и неконтролируемое применение антибиотиков приводит к возникновению и широкому распространению в микробных популяциях R-фактора устойчивости к антибиотикам, передающегося от одной бактериальной клетки к другой при помощи плазмид в процессе коньюгации. Средствами борьбы с проявлением лекарственной устойчивости к антибиотикам является обоснованное и строго контролируемое их применение и получение новых, модифицированных антибиотических препаратов, обладающих биологической активностью к резистентным формам. [2] ЗаключениеВ данной работе были рассмотрены биотехнология антибиотиков и основные стадии получения антибиотиков: стадия биосинтеза антибиотика; стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации; стадия выделения и очистки антибиотика; стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка. А также были рассмотрены все основные методы (культивирования, стерилизации, очистки, выделения), которые могут применяться на данных стадиях. На сегодняшний день основной задачей является не только усовершенствование уже существующих технологий получения антибиотиков, но и поиск новых, более действенных антибиотиков. Следует отметить, что ведутся активные работы по развитию исследований по направленному биосинтезу разнообразных антибиотиков; расширяются работы по химическому синтезу производных этих веществ, химической модификации природных антибиотиков. Список использованной литературы Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. – М. Колосс, 2020. Глик, И.Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология /И.Б.Глик, Дж. Пастернак. – М., Мир, 2022. Шевелуха, В. С. Сельскохозяйственная биотехнология/В. С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, 4-е изд.- М.:Изд-во Высшая школа,2021.-437 с. Современная биотехнология [Электронный ресурс]: сайт по биотехнологии. - Режим доступа: http://www.bionews.ru/news/Bio.htm Биотехнология [ Электронный ресурс ]: сайт по биотехнологии. Режим доступа : http://www.biotechnolog.ru/prombt/prombt1_6.htm |