перевод_статья_5. Исследование (gwas) агрономических признаков и содержания фенолов в генотипах сорго (Sorghum bicolor. L)
 Скачать 1.02 Mb.
|
|
Полногеномное ассоциативное исследование (GWAS) агрономических признаков и содержания фенолов в генотипах сорго (Sorghum bicolor. L) Ye-Jin Lee 1,2 , Baul Yang1 2 , Woon Ji Kim 1 , Juyoung Kim 1 , Soon-Jae Kwon 1 , Jae Hoon Kim 1 Joon-Woo Ahn 1 , Sang 1 Институт передовых радиационных технологий, Корейский научно- исследовательский институт атомной энергии, Чонып-си, провинция Чолла- Пукто, 56212, Республика Корея; yjinlee@kaeri.re.kr (Y.-J.L.), byang@kaeri.re.kr (B.Y.), wjkim0101@kaeri.re.kr (W.J.K.), jykim83@kaeri.re.kr (J.K.), soonjaekwon@kaeri.re.kr (S.-J.K), jaehun@kaeri.re.kr (J.H.K), joon@kaeri.re.kr (J.-W.A.), shkim80@kaeri.re.kr (S.H.K.), jhryu@kaeri.re.kr (J.R.) 2 Кафедра наук о растениеводстве, Высшая школа Национального университета Сунчхон, Сунчхон 57922, Корея; euishik@ scnu.ac.kr (E.-S. R), chbae@scnu.ac.kr (C.-H.B.) 3 Кафедра прикладных наук о растениях, Национальный университет Чонам, Кванджу 61186, Корея; bkha@jnu.ac.kr (B.-K.H.) * Переписка: chbae@scnu.ac.kr (C.-H.B.), jhryu@kaeri.re.kr (J.R.) Аннотация: Сорго (Sorghum bicolor L.) является перспективной культурой биомассы с высоким выходом целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Биомасса сорго стала экологически чистым промышленным материалом, пригодным для производства биотоплива и биопластика. В этом исследовании проводились полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) на основе генотипирования путем секвенирования (GBS), чтобы установить генетическую основу признаков, связанных с биомассой. В частности, исследователи оценили агрономические характеристики и фенольные соединения, используя 96 генотипов сорго. Мы обнаружили шесть фенольных соединений (лютеолинидин диглюкозид, лютеолин глюкозид, апигенинидин глюкозид, лютеолинидин, апигенинидин и 5-O-Me лютеолинидин), причем лютеолинидин является основным фенольным соединением во всех генотипах. Затем был проведен анализ GWAS для подтверждения значительных ассоциаций между 192 040 отфильтрованными однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) и признаками, связанными с биомассой. В ходе исследования было выявлено 40 SNP на 10 хромосомах, которые были в значительной степени связаны с датой колошения (4 SNP), высотой растения (3 SNP), сухим урожаем (2 SNP) и фенольными соединениями (31 SNP). Анализ GWAS показал, что Sbrio.10G099600 был связан с датой заголовка, Sbrio.09G149200 с высотой растения, SBRIO.06G211400 с сухим урожайностью, SBRIO.04G259800 с общим фенольным содержанием и лютеолинидидином, и SBRIO.02G343600 с общим фенольным содержанием и наполняющим содержание и наполняние, а также SBRIO.02G343600 с общим фенольным содержанием и презентацией. эти гены могут сыграть ключевую роль в сорго. Эти результаты демонстрируют потенциальную ценность сорго как ресурса биомассы и возможность отбора генотипов сорго с пониженным содержанием фенолов для использования в биоиндустрии. Ключевые слова: сорго; Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS); Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) 1. Введение Сорго (Sorghum bicolor L.) является пятой по значимости зерновой культурой в мире. Это культура нового поколения с высокоэффективной системой фотосинтеза (С4), что делает ее идеальной для производства промышленных материалов, таких как спирт, топливо и биопластики [1]. Сорго также может служить источником лигноцеллюлозной биомассы для производства химических веществ на биологической основе и биопластических материалов [2]. Поскольку выход биомассы является количественным признаком с низкой наследуемостью, сообщалось, что непрямой отбор имеет аналогичную эффективность при отборе близкородственных признаков с высокой наследуемостью [3]. Основными и наиболее важными компонентами биомассы сорго являются срок колошения [4], высота [5-7], урожай в сухом виде [7,8] и сочность [4]. Кроме того, сахар сорго является важным ингредиентом для пищевой, биотопливной, биопластиковой и фармацевтической промышленности. Увеличение биомассы и потенциала выхода сахара сорго является одной из важнейших целей селекционных программ [2,3]. Однако, несмотря на его большое значение для биоиндустрии, разработка сортов сорго была направлена на повышение урожайности семян и повышение питательной ценности [9]. В этом исследовании наша цель состояла в том, чтобы изучить признаки, связанные с биоиндустрией сорго, поскольку ресурсы стеблей с высоким содержанием сахара и биомассы в Корее ограничены. В то время как естественные мутации имеют очень низкую частоту мутаций от 10-5 до 10-8, ионизирующее излучение может увеличить скорость мутаций примерно в 1000-1 миллион раз по сравнению с естественными мутациями [10-12]. Ионизирующее излучение — это простой, экономичный, экологически чистый и удобный процесс, который можно использовать при безопасных, четко определенных и контролируемых рабочих параметрах [13,14]. На сегодняшний день путем радиационной селекции выведено более 210 видов и около 3402 сортов, в том числе 20 сортов сорго [15,16]. Сорго известно тем, что в его зернах, стеблях и листьях содержится большое количество различных фенольных соединений, таких как флавоноиды, конденсированные дубильные вещества и фенольные кислоты [17,18]. Лигноцеллюлозная биомасса, состоящая из гидрофильных углеводов, использовалась в качестве сырья для производства на основе биомассы или в качестве источника сахара в процессе гидролиза [19]. Сорго — универсальная культура, которую можно использовать для различных целей, в том числе для производства биопластиков [20]. Ферментация полигидроксиалканоатов (ПГА) — это процесс, используемый для производства биоразлагаемых пластиков, которые являются экологически чистыми [21]. ПГА можно получить путем ферментации различных источников углерода бактериями, но фенольные соединения в процессе ферментации могут привести к снижению выхода и продуктивности ПГА [21]. Хотя фенольные соединения оказывают благотворное влияние на здоровье человека, например обладают антиоксидантной и противораковой активностью, они могут затруднить использование лигноцеллюлозной биомассы в качестве материала для производства биомассы [22]. Достижения в технологии секвенирования следующего поколения (NGS) сделали секвенирование ДНК рентабельным до такой степени, что генотипирование путем секвенирования (GBS) теперь возможно для видов с большим геномом и высоким генетическим разнообразием [23]. Поскольку GBS одновременно проводит обнаружение SNP и генотипирование, предварительные знания генома вида не требуются [24]. Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) были приняты в качестве полезного подхода для идентификации генов-кандидатов, лежащих в основе количественных и качественных признаков [25]. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), выявленные с помощью GBS, позволяют проводить анализ генетического разнообразия и интеграцию с GWAS в единый исследовательский проект [26]. Основной принцип GWAS заключается в интеграции данных о генотипе и фенотипе с помощью общих линейных моделей или смешанных линейных моделей (MLM) [27]. В настоящее время GWAS успешно используется с мутантами в различных представляющих интерес культурах, в том числе для причинных SNP для агрономических и фитохимических признаков у Sorghum bicolor, Brassica napus и Glycine max [28-30]. Это исследование было направлено на оценку генетической изменчивости 59 мутантных линий сорго, индуцированных радиацией, и 37 генетических ресурсов сорго во всем мире с использованием данных SNP высокой плотности. Кроме того, исследование стремилось идентифицировать гены-кандидаты, связанные со значительными агрономическими признаками и фенольными соединениями, с помощью анализа GWAS. 2. Материалы и методы 2.1. Растительные материалы и экстракция ДНК Генетические ресурсы включали 96 генотипов сорго, в том числе 37 отобранных генотипов из GenBank Ассоциации развития сельских районов (RDA) и Международного научно-исследовательского института сельскохозяйственных культур для полузасушливых тропиков (ICRSAT). Эти отобранные генотипы оценивались на пригодность к производству семян и широкий спектр агрономических и фенольных характеристик в течение трех лет в Институте передовых радиационных технологий Корейского научно- исследовательского института атомной энергии (KAERI) в Чоныпе, Чоллабук, Республика Корея (35,5699°N 126,9722). °Э). Пятьдесят девять мутантных линий сорго были индуцированы обработкой семян исходного сорта различными дозами гамма-излучения (60Co) и облучением пучком протонов в KAERI. Восемнадцать мутантных линий от Banwoldang (Корея), двенадцать мутантных линий от Dansusu2 (Корея), пять мутантных линий от KLSo79125 (Корея), шесть мутантных линий от Pahat (Индонезия), четыре мутантных линии от IS5718 (Индия), три мутантных линии от IS645 (США), три мутантные линии от DINE-A-MITE (неизвестно), две мутантные линии от Moktak (Корея), одна мутантная линия от Chalsusu1 (Корея), одна мутантная линия от High-land-sweet (неизвестно), одна мутантная линия линия от IS2868 (Южная Африка), одна мутантная линия от Mesusu (Корея) и две мутантные линии от IS2864 (Южная Африка), использованные в этом исследовании (табл. 1). Вкратце, обработанные семена высевали для получения семян М1 от одного растения и собирали основные колосья каждого растения М1. В поколении М2 все особи были исследованы на наличие агрономических мутаций исходного сорта. Мутанты сорго были отобраны на основе их агрономических характеристик и содержания фенольных соединений, которые были получены из поколений М3 и М4. Процедура самооплодотворения продолжалась до поколения М5. Наконец, было отобрано пятьдесят девять мутантов, различающихся по агрономическим характеристикам и содержанию фенольных соединений и демонстрирующих стабильное наследование мутантных характеристик от поколений М5. Геномную ДНК экстрагировали из молодых листьев каждой особи с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) и количественно определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, 112 USA). Концентрации ДНК доводили до 50–100 нг/мкл (всего 30–50 мкл на 113 образцов) для анализа GBS. Таблица 1. Происхождение, агротехнические признаки и общее содержание фенолов в 96 генотипах сорго, использованных в этом исследовании. 1 дата заголовка; 2 высота растения; 3 содержание растворимых твердых веществ; 4 сухой выход, 5 общее содержание фенолов. 2.2. Оценка агрономических признаков и содержания растворимых сухих веществ Агрономические признаки, такие как дата колошения (HD), высота растения (PH), урожай в свежем виде (FY), урожай в сухом виде (DY) и содержание растворимых сухих веществ (SC). Дату колошения оценивали как количество дней между посевом и колошением, при этом последняя представляла собой стадию, на которой 50% растений собирали метелки. Высоту растений, содержание растворимых сухих веществ и урожай в свежем виде измеряли в сроки сбора семян каждого генотипа. Содержание растворимых сухих веществ (по шкале Брикса) определяли с помощью ручного рефрактометра (OPT-I, Bellingham & Stanley Ltd., Англия) по соку главного стебля на высоте 15 см над землей. Урожай в свежем виде определяли вес всего растения в свежем виде, за исключением метелки, который затем рассчитывали как произведение между урожайностью обрабатываемого погонного метра (3,3 м2) и общим количеством обрабатываемых погонных метров на гектар. Сухой урожай рассчитывали механически на основе урожая в свежем виде: FY (т/га) × среднее соотношение сухого вещества. 2.3. Анализ с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) В сроки сбора семян были собраны целые образцы растений (за исключением метелок) из 96 генотипов сорго. 50 г свежих образцов помещали в стеклянную емкость объемом 1000 мл со 100%-ным этанолом и инкубировали при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем экстракты фильтровали через мембранный фильтр 0,45 мкм с использованием шприцевого фильтра. Отфильтрованные экстракты переносили во флаконы на 2 мл и анализировали с использованием системы UPLC (CBM-20A, Shimadzu Co., Киото, Япония). Экстракт каждого образца анализировали с использованием системы UPLC, соединенной с матричным фотодиодным детектором (DAD; Agilent серии 1260; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) и квадрупольным жидкостным хроматографом/масс- спектрометром (Agilent 6130; Agilent Technologies, Санта-Клара, США). Калифорния, США) с колонкой Poroshell 120 SB-C18 (Agilent Technologies) и совместимой защитной колонкой C18 (Phenomenex, Torrance, CA, США). Подвижная фаза состояла из 0,05% муравьиной кислоты в воде (А) и ацетонитрила (Б) с 0,05% муравьиной кислоты. Общее содержание фенолов определяли при 320 нм. Стандартное соединение для общего содержания фенолов (лютеолинидин) растворяли в 80% этаноле (об./об.). 2.4. Генотипирование путем секвенирования Генотипические данные из всех 96 образцов были получены с использованием стратегии генотипирования путем секвенирования (GBS). Библиотеки GBS конструировали с использованием рестрикционного фермента Apek I, и адаптеры со штрих-кодом лигировали с расщепленными фрагментами. В дополнительной таблице S1 перечислены 96 последовательностей штрих-кодов, используемых для маркировки образцов. Подходящая концентрация адаптера была определена и использована для создания библиотеки в соответствии с протоколом GBS с небольшими изменениями [23]. Библиотеку GBS секвенировали с использованием платформы Illumina HiSeq X Ten от SEEDERS Co. (Тэджон, Корея). Демультиплексирование выполнялось с использованием последовательностей штрих-кодов, а последовательности адаптеров удалялись. Последовательности низкого качества были обрезаны с использованием Cut Adaptive (версия 1.8.3) для обрезки адаптера и DynamicTrim и LengthSort SolexaQA (версия 1.13) для обрезки качества последовательности [31,32]. Сохраненные чистые чтения для каждого образца были сопоставлены с эталонным геномом Sorghum bicolor Rio_v2 с использованием программного обеспечения BWA (версия 0.7.17-r1188), а файлы выравнивания были преобразованы в файлы BAM с использованием программного обеспечения SAMtools (версия 0.1.16) [33-35]. ]. Перед обнаружением необработанных SNP была выполнена проверка 158 SNP с использованием собственного сценария, разработанного SEEDERS [36]. SNP были функционально и структурно аннотированы с использованием инструмента SnpEff (версия 4.3) и аннотированного генома сорго, доступного в базе данных Phytozome (https://phytozomenext.jgi.doe.gov/) [37]. Положения SNP были классифицированы как межгенные или генные области на основе информации о положении эталонного генома. Генные области были дополнительно классифицированы на CDS или интронные области. Общие SNP из эталонной последовательности были выбраны для разделения генотипов в матрице SNP, а полиморфные SNP были выбраны путем сравнения общих SNP с последовательностью оснований каждого генотипа Sorghum bicolor Rio_v2. 2.5. Полногеномное исследование ассоциации (GWAS) с агрономическими признаками и фенольными соединениями Для анализа GWAS было использовано в общей сложности 192 040 отфильтрованных SNP с частотой минорного аллеля более 5% и недостающими данными менее 30%. BLINK, Farm CPU, MLMM и MLM использовались для выполнения анализа GWAS, при этом все параметры были установлены на значения по умолчанию в R-пакете интегрированного инструмента геномной ассоциации и прогнозирования (GAPIT) [38]. Порог значимости ошибки типа I для этого исследования был установлен равным 0,0001 [39]. Значимые SNP были классифицированы на основе их p-значений с использованием графика квантилей-квантилей и графика Манхэттена. Среди них были повторно отобраны важные SNP, расположенные в генных областях, исключая межгенные области. Геномное положение и информация о генах- кандидатах были получены из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) с использованием эталонных геномов Sorghum bicolor Rio_v2.1 и OZ sorghum (https://aussorgm.org.au). 3. Полученные результаты 3.1. Подраздел Хозяйственные признаки генотипов сорго Описательная статистика была проведена по четырем агрономическим признакам (HD, PH, SC и DY) в 96 генотипах сорго (таблица 1). HD колебалась от 58,0 (Банволданг-7) до 115,0 дней (Пионер-931), при среднем значении 87,8 дня. PH варьировал от 89,0 (Dansusu 2-8) до 465,0 см (DINE-A-MITE-1), в среднем 282,0 см. SC варьировался от 5,0 (IS5718 и Dansusu 2-8) до 18,8° по шкале Брикса (Dansusu1 и Dansusu4), в среднем 13,4° по шкале Брикса. DY колебался от 2,4 (Дансусу 2-8) до 26,1 т/га (ИС645-3 и Моктак-2), при среднем значении 13,0 т/га. Четыре агрономических признака имели непрерывную изменчивость в соответствии со значениями их эксцесса и асимметрии (таблица 2). Таблица 2. Сводка агрономических признаков 96 генотипов сорго, использованных в этом исследовании. 1 HD, дата заголовка; PH, высота растения; SC, содержание твердых веществ; DY, сухой выход. 3.2. Анализ UPLC в генотипах сорго Общее содержание фенолов (TPC) в линиях сорго показано в таблице 1. Подробная информация о шести фенольных соединениях представлена в таблице S2. Хроматограммы УЭЖХ выявили наличие шести пиков (рис. 1). Было выделено шесть фенольных компонентов: диглюкозид лютеолинидина, глюкозид лютеолина, глюкозид апигенинидина, лютеолинидин, апигенинидин и 5-O-Me-лютеолинидин. Шесть типов содержания фенолов представляли собой диглюкозид лютеолинидина, в диапазоне от 0,09 (Икумба, рис. 2А) до 0,46 мг/100 г (Банволданг, рис. 2Н), в среднем 0,23 мг/100 г. Глюкозиды лютеолина варьировали от 0,00 (Сорго-медовое и др., рис. 2Б) до 1,24 мг/100 г (Пахат-5, рис. 2И), в среднем 0,30 мг/100 г. Диапазон глюкозида апигенинидина был от 0,02 (Dansusu2-10, рисунок 2C) до 1,18 мг/100 г (Bitjaru, рисунок 2J), в среднем 0,40 мг/100 г. Лютеолинидин варьировался от 0,06 (Пахат-4, рис. 2D) до 5,20 мг/100 г (горно-сладкий, рис. 2K), в среднем 1,64 мг/100 г. Диапазон апигенинидина был от 0,00 (Dansusu2-12, рис. 2E) до 0,75 мг (Bitjaru, рис. 2L), в среднем 0,32 мг/100 г. 5-O-Me-лютеолинидин варьировался от 0,01 (Dansusu2-12, рис. 2F) до 0,43 мг/100 г (горно-сладкий, рис. 2M), в среднем 0,21 мг/100 г. Общее содержание фенолов колебалось от 1,92 (Пахат-4, рис. 2G) до 13,10 мг/100 г (IS645-2, рис. 2N), в среднем 6,37 мг/100 г. IS645-2 увеличил TPC на 6,43 мг/100 г по сравнению с исходным сортом (рис. 1). Лютеолинидин составлял наибольшую долю (26,8%) TPC. Фенольные соединения показали непрерывные вариации с нормальным распределением в соответствии с асимметрией и эксцессом (таблица 3). |