ответы на вопросы по иммунологии. Исторические этапы взаимодействия человека с инфекцией

• Название: Исторические этапы взаимодействия человека с инфекцией
• Анкор: ответы на вопросы по иммунологии
• Дата: 11.06.2020
• Размер: 445.09 Kb.
• Имя файла: 1-31.docx
• Тип: Книга; #129530
• страница: 6 из 6

28) Конститутивные (нормальные) антитела. Природа. Свойства. Функции. Понятие о микроглобулинах

Если в организм не проникает ни один патоген и ни один Аг иной природы (это, конечно, возможно только в эксперименте), в крови и биологических жидкостях этого организма тем не менее будут присутствовать (и в немалом количестве) иммуноглобулины. Есть они и у естественно развивающихся организмов. Такие иммуноглобулины называют нормальными, или конститутивно синтезируемыми. Что это за иммуноглобулины? Это аутоантитела, т.е. АТ, направленные против молекул собственного организма. Они принадлежат к классам М, G и А, у взрослых большинство — к IgG. АТ полиреактивны, т.е. способны связывать множество Аг, как ауто–, так и экзогенных. В связывании Аг этими нормальными АТ, как показывают опыты по направленному мутагенезу, принимает участие область CDR3 в V_H–домене тяжёлых цепей и Аг–связывающий центр кодируется зародышевыми V–генами.

Как правило, эти АТ имеют низкую аффинность, но высокую авидность к аутоантигенам. Константы диссоциации для нормальных иммуноглобулинов колеблются от 10^–5 до 10^–8 М. Но, например, для нормального аутоантитела к ИЛ–1a константа диссоциации составляет 5´10^–11 M. Нормальные IgM–АТ обнаруживают уже в пуповинной крови новорождённых, и спектр их реактивности консервативно сохраняется во взрослой жизни. Это говорит о том, что нормальные иммуноглобулины подвержены некоему положительному отбору в онтогенезе. Выявлены следующие Аг — мишени для нормальных иммуноглобулинов: идиотопы вариабельных областей других иммуноглобулинов; каркасные и невариабельные участки молекул T–клеточных Рц для Аг; молекулы CD4, CD5 и HLA–I; Fcg–Рц; лиганды для молекул межклеточной адгезии и др.

Есть основания полагать, что нормальные АТ выполняют ряд весьма важных для здоровья организма функций:

· первая линия «обороны» против инфекций;

· удаление из организма отживших клеток и продуктов катаболизма;

· представление Аг для T–лимфоцитов (иммуноглобулины на мембране B–лимфоцитов связывают растворимые Аг в крови, лимфоцит интернализует их рецепторопосредованным эндоцитозом, и внутри клетки образуются комплексы пептидов с молекулами главного комплекса гистосовместимости, которые экспрессируются на мембране B–лимфоцита);

поддержание гомеостаза аутоиммунной реактивности;

· противовоспалительное действие (нейтрализация суперантигенов; индукция синтеза противовоспалительных цитокинов; аттенуация комплементзависимого повреждения тканей и др.).

Например, появляются данные о том, что в случае клинической манифестации некоторых патологических аутоиммунных болезней, в патогенезе которых действуют IgG–аутоантитела, имеет место дефект регуляции этих патогенных IgG со стороны нормальных антиидиотипических IgM–АТ. Показано, что в периоды ремиссии аутоиммунных васкулитов, в патогенезе которых действуют антинейтрофильные IgG–АТ (ANCA), в крови в достаточных количествах появляются антиидиотипические по отношению к ANCA IgM–АТ. Вероятно, лечебные эффекты от введения людям с разными заболеваниями препаратов донорских иммуноглобулинов объясняются именно комплексным «противовоспалительным» действием нормальных иммуноглобулинов.

29) Моноклональные антитела. Принцип получения. Использование в клинической и лабораторной практике

Моноклональные антитела. Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в ре­зультате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природ­ных условиях макроорганизма получить моно­клональные антитела практически невозмож­но. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначи­тельно различающихся антигенной специфич­ностью рецепторов и, естественно, аффиннос­тью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем поликлональные антитела.

Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести пред­варительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений.

Проблема получения моноклональных ан­тител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммун­ных В-лимфоцитов с миеломной (опухоле­вой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопродуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток полу­чил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неогра­ниченном количестве вырабатывает антите­ла. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных кле­ток, обладавшие наивысшей продуктивнос­тью и наибольшей аффинностью специфи­ческих антител.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В послед­нем случае моноклональные антитела накап­ливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются гибридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартиза­ции и используют для создания на их основе диагностических препаратов.

 Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиоло­гических препаратов.

30) Методы изучения гуморального звена иммунитета

Антиглобулиновый тест (реакция Кумбса). Антиглобулиновый тест служит для доказательства присутствия в сыворотке неагглютинирующих или «неполных» антител. Наиболее часто этот метод используют при диагностике болезней крови, обусловленных иммунным гемолизом. Первоначально исследователи применяли антиглобулиновую сыворотку (против глобулина человека), однако позднее было установлено, что она реагирует с компонентами комплемента. В настоящее время вместо нее интенсивно внедряют моноспецифические антисыворотки против определенных классов Ig (моноклональные антитела). Прямой вариант теста служит для обнаружения связанных с клеткой «неполных» антител; при непрямом варианте выявляют циркулирующие антитела: исследуемую сыворотку предварительно инкубируют с эритроцитами, а затем воспроизводят прямой тест. Разработана постановка антиглобулинового теста в комбинации с пассивной гемагглютинацией для выявления как неагглютинирующих аутоантител, так и реагинов. И, наконец, непрямая техника флюоресценции - это также одна из модификаций антиглобулинового теста.

Тест потребления антиглобулина (тест Штеффена). Следует обратить внимание на этот метод, хотя в данном случае мы имеем дело лишь с индикаторной реакцией. С помощью этого теста можно выявить антитела к антигенам клеток тканей, клеточных ядер или нерастворимых элементов тканей. Определить эти антитела с помощью реакции агглютинации невозможно. При непрямом варианте теста антигены (гомогенизированные ткани) инкубируют с исследуемой сывороткой, а затем тщательно отмывают для удаления несвязанных антител. Далее с этим гомогенатом инкубируют антиглобулиновую сыворотку с заранее известным титром. В результате происходит потребление антиглобулина антителами, адсорбированными на тканях. В соответствии с этим титр антиглобулиновой сыворотки снижается. Уровень исследуемых антител до и после инкубации определяют с помощью индикаторной системы, состоящей из сенсибилизированных неполными антителами эритроцитов, поэтому данный вариант можно рассматривать как модификацию реакции торможения гемагглютинации. При постановке прямого варианта теста предварительную инкубацию с исследуемой сывороткой не производят.

Данный метод применяют для определения аутоантител при ревматоидном артрите, антител к ДНК при системной красной волчанке, а также для доказательства выработки антител к антигенам на лейко- и тромбоцитах. Метод зависит и от многочисленных неспецифических факторов - вот почему особую важность приобретают соответствующие способы контроля. При интерпретации результатов не следует забывать, что общепринятая техника может демонстрировать связывание глобулинов, не всегда обусловленное комплексом антиген-антитело.

Реакция связывания комплемента. Это непрямой метод для выявления антител или антигенов. Реакция основана на том, что комплемент принимает участие в многочисленных реакциях типа антиген-антитело. Постановку опыта осуществляют в два этапа: на I этапе исследуемую сыворотку и известный антиген инкубируют с комплементом, на II - готовят индикаторную систему, состоящую из гемолитической сыворотки и эритроцитов, и добавляют к смеси реагентов. Если I этап опыта завершается реакцией антиген-антитело, то происходит связывание комплемента, при этом гемолиз индикаторных эритроцитов отсутствует или выражен незначительно. Если в исследуемой системе не образуется комплекс антиген-антитело, то комплемент полностью включается в индикаторную систему, что приводит к гемолизу. В качестве источника комплемента обычно служит свежая сыворотка крови морской свинки. Ее комплемент реагирует с антителами всех видов млекопитающих. В индикаторной системе используют, как правило, эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к эритроцитам барана.

РСК - это довольно чувствительный метод, который позволяет выявить антитела в концентрации 0,05 мг/л, его применяют прежде всего при диагностике инфекционных заболеваний (сифилис, вирусные инфекции), а также в ряде случаев для доказательства аутосенсибилизации. Читать подробнее Иммунологические методы с использованием меченых антигенов и антител

Реакция иммунного гемолиза и цитотоксический тест. Иммунный гемолиз может служить доказательством, с одной стороны, активности комплемента, с другой - цитотоксического эффекта антител к эритроцитам, поэтому указанные реакции важны для иммуногематологической диагностики. Пассивную гемагглютинацию можно преобразовать в реакцию пассивного гемолиза, при этом смесь реагентов должна состоять из антител, эритроцитов, нагруженных соответствующим антигеном, и комплемента.

Цитологический тест информативен при изучении патогенетических механизмов. Тем не менее возможности его использования довольно ограничены, учитывая сложность методов клеточного культивирования. Цитотоксические реакции могут быть опосредованы антителами (активация комплемента), клетками-киллерами и сенсибилизированными Т-лимфоцитами.

Тест нейтрализации. Принцип теста состоит в том, что определенные биологические свойства антигена нейтрализуются при воздействии антител. Наиболее широко его применяют для выявления антитоксических (столбняк, дифтерия) и антивирусных антител.

Прочие методы. Кроме методов, ранее описанных в отдельных главах (анафилаксия in vitro по Шульцу-Дейлу, освобождение гистамина из базофильных гранулоцитов и тучных клеток, кожные пробы, «разрешающая» доза аллергена как тест оценки иммунного ответа, пассивная кожная анафилаксия и реакция Прауснитца-Кюстнера), следует назвать способы доказательства продукции IgE, диагностические тесты для анализа иммунных комплексов, методы выявления аутоантител при аутоиммунных заболеваниях.

31) Принципы и методы иммунизации лабораторных животных.

Подкожное заражение. Материал вводят в складку кожи, которую захватывают пальцами на спине, у корня хвоста (мышь), на животе (морские свинки, кролики). Прокалывают складку иглой, вводят иглу примерно наполовину, медленно впрыскивают материал. После этого отпускают складку кожи, накладывают на иглу кусочек ваты и быстро вынимают иглу. Во избежание выхода инъецированной жидкости иглу вынимают под углом 45º. Место введения обрабатывают спиртом.

Накожное заражение. На участок кожи, лишенный шерсти и продезинфицированный наносят царапину с помощью иглы или скарификатора. На царапину капают каплю заразного материала и втирают его в кожу шпателем или стеклянной палочкой.

Внутрикожное заражение. Накануне введения шерсть на боку или спине животного (кролики, морские свинки) подстригают, а затем выбривают. Тонкую иглу вводят острым углом в приподнятую складку кожи под эпидермис. Жидкость вводят в объеме 0,1-0,2 мл, при этом используют туберкулиновый шприц. В результате на месте введения поверхностный слой эпидермиса приподнимается в виде бугорка.

Внутримышечное заражение. Материал вводят длинной иглой глубоко в мышцу бедра, а у птиц – в мышцу груди.

Внутривенное заражение. Для этого способа заражения у кроликов используют краевую вену уха, у морских свинок – ушную и яремную, у кошек и собак – яремную и бедренную, у мышей и крыс – хвостовую вену, причем перед впрыскиванием хвост животных погружают в теплую воду, чтобы вызвать гиперемию. Место введения дезинфицируют, тщательно протирают ксилолом для набухания вены. Материал вводят тонкой иглой по направлению тока крови.

Внутрибрюшинное (интраперитонеальное) заражение. Животное держат вниз головой, чтобы внутренности брюшной полости опустились к диафрагме. При этом образуется свободное место для иглы. Укол делают в нижней трети живота, но не слишком низко. Это уменьшает опасность повреждения отдельных участков кишечника, мочевого пузыря и половых органов. Место инъекции дезинфицируют, берут складку кожи как при подкожном заражении, вводят в нее иглу, поворачивают под прямым углом и быстрым толчком прокалывают брюшную стенку. При таком способе заражения можно ввести большое количество заразного материала.

Заражение через пищеварительный тракт (пероральное). Наиболее простым способом является смешивание исследуемого материала или микробной взвеси с кормом, однако при этом нельзя учесть дозу инфекта. Более точные результаты получают при закапывании материала пипеткой через рот. При этом животное фиксируют в вертикальном положении, надавливанием пальцами на щеки или пинцетом открывают рот и медленно капают, давая проглотить каждую каплю. Для данного метода заражения используют также тонкий зонд, который вводят через нос. На наружный конец зонда надевают шприц. Это также позволяет дозировать вводимый материал. Мелких животных заражают при помощи шприца, на который надевают иглу с утолщением на конце в виде оливы.

Заражение через нос (интраназальное). Производят закапывание материала в нос пипеткой или иглой, надетой на шприц. Лучше такое заражение осуществлять под легким наркозом.

Внутричерепное (интрацеребральное) заражение. Мышей и крыс заражают как под наркозом так и без него. Заразный материал вводят на расстоянии 1-2 мм от точки пересечения средней линии черепа с линией, соединяющей наружные углы глаз. Место укола дезинфицируют. Для заражения используют туберкулиновый шприц с тонкой иглой. Кроликов и морских свинок заражают путем прокола тонкой кости в области надглазничной борозды. Испытуемый материал необходимо вводить медленно, чтобы не вызвать резкого повышения внутричерепного давления и предупредить обратный выход вводимого материала. У крупных животных производят трепанацию черепа.

Заражение через глаз (интроокулярное) можно проводить различными способами. Заражение через конъюктиву кролику или морской свинке проводят в задний угол глаза, капая одну каплю материала из пипетки.

При субконъюктивальном заражении тонкой иглой вводят 0,2-0,5 мл материала под конъюктиву. Образуется небольшой пузырек, который быстро рассасывается.

Заражение через прямую кишку (перректальное). Заражение производят путем введения заразного материала, суспендированного в физиологическом растворе, имеющем температуру тела, при помощи клизмы.